《International Journal of Molecular Sciences》：Novel 3-Amino-2-methylquinazolinone NF-κB Inhibitors: Synthesis and Potential Anti-Inflammatory Function
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经典NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）通路是炎症反应的主要调节因子，其持续激活与慢性炎症疾病和癌症发展相关。因此，开发有效的NF-κB抑制剂对于潜在的临床前
经典NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）通路是炎症反应的主要调节因子，其持续激活与慢性炎症疾病和癌症发展相关。因此，开发有效的NF-κB抑制剂对于潜在的临床前研究至关重要。在本研究中，研究人员使用新颖的方法合成了多种喹唑啉酮（quinazolinone）化合物。研究人员具体采用了两步法，将已有方案与改进的替代方案进行比较，然后成功建立了一种新颖的一锅多组分反应（one-pot multi-component reaction）。所有喹唑啉酮均基于其抑制肿瘤坏死因子（TNF）诱导的NF-κB激活的能力进行测试，使用商业转基因HeLa报告细胞系。在测试的18个分子中，有两个化合物影响了NF-κB依赖的荧光素酶（luciferase）活性，即5o（3-氨基-6-羟基-2-甲基喹唑啉-4(3H)-酮）和10（N-(6-溴-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)-4-硝基苯甲酰胺）。但只有5o（在R1（6位）带有OH）在脂多糖（LPS）刺激的人原代巨噬细胞（primary macrophage）培养中减弱了促炎性白细胞介素6（IL-6）的产生。分子对接（molecular docking）分析提供了支持性计算证据，表明5o可以与p65/DNA复合物相互作用，因此有可能被开发用于进一步研究以抑制经典NF-κB通路。
4(3H)喹唑啉酮（QNZ）骨架是一种富含氮的杂环结构，广泛存在于天然生物碱中，并被认为是“特权”药物骨架。3-氨基-2-甲基喹唑啉酮及其衍生物已被报道具有抗肿瘤和抗炎活性，其作用机制涉及对DNA修复酶WRN（Werner syndrome）解旋酶、VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）通路及经典NF-κB（核因子κB）通路的抑制。NF-κB转录因子家族（以p50:RelA(p65)异源二聚体为主）是炎症反应的关键调控枢纽，其持续激活与慢性炎症性疾病（如炎症性肠病、类风湿关节炎）及癌症发生发展（包括增殖、转移、血管生成和耐药）密切相关。因此，开发针对NF-κB通路的有效抑制剂具有重要临床前研究价值。研究人员此前已鉴定出一种新型喹啉分子Q3可抑制经典NF-κB通路。基于此，本研究旨在通过改进合成方法制备新型3-氨基-2-甲基喹唑啉酮化合物，并评估其作为NF-κB抑制剂的潜在抗炎功能。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
研究人员采用两步法（高压釜加热）及一锅多组分反应（微波辅助）合成了15个3-氨基-2-甲基喹唑啉酮（5a–o），并进一步合成了4个酰胺衍生物（7–10）。通过商业HeLa/NF-κB-Luc报告细胞系检测化合物对TNF诱导的NF-κB活化（荧光素酶活性）的影响，并利用人原代巨噬细胞培养评估对LPS诱导的IL-6产生的抑制作用。分子对接分析（AutoDock 4.2）用于预测化合物与p65/NF-κB及p65/NF-κB-DNA复合物的结合能力。人原代巨噬细胞来源于健康志愿者外周血单核细胞（PBMCs），经Ficoll分离、M-CSF分化获得，伦理批准由塞萨利大学研究伦理委员会（54/5 June 2025）授予。
**2.1. 3-氨基-2-甲基喹唑啉酮的合成**：通过两步法（高压釜中乙酸酐处理生成苯并噁嗪酮，再与水合肼在乙酸中反应）及一锅法（邻氨基苯甲酸、原乙酸三乙酯和水合肼在微波辅助下反应）合成了15个目标化合物。比较发现，高压釜两步法产率优于此前微波法，而一锅法进一步提高了产率（4–25%），但硝基衍生物（5k, 5l）反应受阻。酰胺衍生物7–10由溴代化合物5g衍生得到。
**2.2. 喹唑啉酮对HeLa/NF-κB Luc细胞活力的影响**：通过碘化丙啶染色及流式细胞术检测，所有化合物在10 μM浓度下孵育24 h均未对细胞活力产生显著影响（p > 0.05），表明无细胞毒性。
**2.3. 特定喹唑啉酮抑制TNF诱导的HeLa/NF-κB-Luc细胞中NF-κB活化**：荧光素酶报告基因检测显示，在无TNF刺激时，化合物5d、5f、5n显著诱导荧光信号（p < 0.001），故排除后续实验。在TNF刺激下，仅化合物5o和10显著抑制NF-κB依赖的荧光素酶表达，抑制率约50%（p < 0.001）。进一步在人原代巨噬细胞中，LPS刺激后，仅有5o显著降低IL-6的产生（7.4006 ± 3.3322 ng IL-6/mg蛋白 vs 对照7.8539 ± 3.2079 ng IL-6/mg蛋白，p < 0.05），而10和5k无效。
**2.4. 分子对接分析**：分子对接计算了化合物与p65/NF-κB及p65/NF-κB-DNA复合物的结合能。5o和10均表现出良好的结合能，且对全复合物（p65/NF-κB-DNA）的结合能更低（更负），提示可能通过干扰DNA结合发挥抑制作用。5o的结合能优于10，与体外活性一致。
讨论部分指出，两步法中高压釜替代微波提高了产率，一锅法进一步优化。构效关系分析表明，5o的6位羟基（OH）的氢键能力是抑制NF-κB活性的关键，而5m（6-甲氧基）无活性，证实了氢键的必要性。化合物10的酰胺化将非活性前体5g转化为活性分子，提示3-氨基的衍生化值得进一步探索。分子对接支持5o与p65/DNA复合物的相互作用。研究结论翻译如下：本研究令人信服地展示了合成3-氨基-2-甲基喹唑啉酮的新方法。在所有测试的分子中，只有带有OH在R1（6位）的5o抑制了NF-κB激活和IL-6的合成。总之，数据表明QNZ 5o是一个有前途的先导化合物，可用于未来靶向NF-κB通路的优化尝试。
