《International Journal of Molecular Sciences》：A Colon Cancer Organoid-on-a-Chip Model for In Vitro Therapy Assessment
编辑推荐：
结肠癌是导致死亡的主要原因之一，因此需要依赖模型来开发新药的先进治疗策略。传统细胞培养模型无法准确且精确地重现肿瘤微环境（tumor microenvironment）的复杂性，从而限制了其在研究和治疗开发中的适用性。为解决这一不足，患者来源类器官（patie
结肠癌是导致死亡的主要原因之一，因此需要依赖模型来开发新药的先进治疗策略。传统细胞培养模型无法准确且精确地重现肿瘤微环境（tumor microenvironment）的复杂性，从而限制了其在研究和治疗开发中的适用性。为解决这一不足，患者来源类器官（patient-derived organoids）已成为很有前景的体外（in vitro）模型。将这些基于类器官的模型整合到更具生理相关性的系统中，预计将提高其临床相关性。因此，将这些类器官整合到充当生物反应器（bioreactors）的微流控芯片中，可能提升个体化医疗（personalized medicine）中治疗反应的预测能力。
本文报道了一种新型结肠癌类器官芯片（organoid-on-a-chip）模型的开发，该模型可在持续培养基流动条件下实现患者来源结肠癌类器官的体外培养。研究人员展示了所开发类器官来源于结直肠癌患者肿瘤活检样本，经标准三维（3D）培养扩增后，再于微流控芯片内培养。该微流控芯片腔室经专门设计，可在受控环境中容纳类器官，允许治疗药物注入并通过光学显微镜进行实时监测。所测试的体外治疗为基于5-氟尿嘧啶（5-FU）和奥沙利铂（oxaliplatin）的不同浓度药物联用方案。结果首次证明，该模型证实了此项技术用于结肠癌治疗体外测试的能力。
该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》，核心工作是构建并验证一种患者来源结直肠癌类器官芯片（organoid-on-a-chip）模型，用于体外药物疗效评估。研究背景在于，结直肠癌是全球高发且高致死性的恶性肿瘤之一，临床药物研发失败率较高，重要原因之一是现有临床前模型难以充分反映人体肿瘤的真实生物学特征。传统二维（2D）细胞培养无法再现肿瘤微环境（tumor microenvironment）的空间结构、营养梯度及细胞异质性；动物模型虽然可提供整体层面的信息，但对人源肿瘤组织和微环境的模拟仍有限。因此，建立兼具人源性、三维结构和动态培养特征的新型模型，成为提高药物筛选有效性和推动个体化治疗的重要需求。
在这一背景下，研究人员将患者来源的结直肠癌类器官与微流控器官芯片（organ-on-chip, OoC）技术结合，开发出可连续灌流培养的微流控系统。该系统通过持续供给新鲜培养基，在更接近体内的动态环境下维持类器官生长，并支持药物注入、形态学实时观察及增殖标志物检测。研究同时纳入同一患者的肿瘤组织和邻近非肿瘤组织来源类器官，在微流控芯片与常规培养板中平行培养，并对5-氟尿嘧啶（5-FU）联合奥沙利铂（oxaliplatin）的不同浓度处理反应进行比较。研究结果表明，该平台不仅能够支持患者来源类器官在连续流动条件下稳定生长，而且能够再现实验性化疗的剂量依赖性效应；芯片培养与培养板培养在总体药物反应趋势上具有一致性，同时芯片系统因其连续灌流和更稳定的实验环境而具有更强的生理相关性。该研究的意义在于，为结直肠癌体外药敏评估提供了一种具有转化潜力的新平台，并为未来精准医学中的个体化用药预测奠定了方法学基础。
研究人员采用的主要技术方法包括：基于患者肿瘤活检及邻近非肿瘤组织建立类器官培养体系；以聚二甲基硅氧烷（PDMS）和玻片制备带有预腔室和培养腔室的微流控芯片，并通过持续灌流系统实现0.26 μL/min动态培养；采用明场显微镜进行类器官生长与药物反应监测；采用苏木精-伊红（H/E）染色及免疫组织化学检测Ki-67、CK20、CDX2进行组织学表征；通过免疫荧光检测Hoechst、CK20和Ki-67评估细胞核、上皮结构与增殖状态。样本来源为西班牙马德里Hospital Clínico San Carlos经伦理审批并取得知情同意的结肠癌患者活检组织；正式验证阶段选取1例同时具有肿瘤和非肿瘤组织的患者开展概念验证。
以下为论文结果部分的凝练解读。
2.1. Development of the Microfluidic Chip and Implementation of the Microfluidic System
研究人员首先设计并构建了新的微流控芯片系统。该芯片由培养腔室、预腔室及连接两者的微流控通道组成，样本置于培养腔室，药物和荧光标志物可通过聚四氟乙烯（PTFE）塞经预腔室注入。系统外接注射器与灌流泵，实现持续培养基流动并将废液导入收集管。实验中对系统密闭性进行了评估，确保整个实验过程无渗漏。该结果说明研究人员已建立可用于连续供液和原位干预的微流控培养平台，为后续类器官培养和药物测试提供了硬件基础。
2.2. Derivation and Temporal Behavior of Organoids from Colorectal Cancer Biopsies in Culture Plates
研究人员通过消化患者肿瘤和非肿瘤活检组织获得类器官，并先在标准三维培养板中扩增。结果显示，类器官约于10 d形成，且随时间推移在尺寸、密度和复杂性方面持续增加。肿瘤类器官从早期小而边界不清的结构逐渐演变为具有异质性的大型团簇，平均直径由第6天约60 μm增至第16天约175 μm；非肿瘤类器官平均直径由第6天约55 μm增至第16天约200 μm。该结果表明，来源于活检组织的类器官生成方案有效，能够支持长期存活和持续生长。
随后，研究人员采用组织学与免疫组织化学方法对类器官进行表征。H/E染色显示，非肿瘤类器官结构较有序，而肿瘤类器官核形态不规则，缺乏肠组织典型柱状结构。Ki-67在肿瘤和非肿瘤类器官中均有表达，提示培养体系支持细胞增殖；CK20和CDX2高表达则证实所形成类器官来源于结肠组织，并包含向肠上皮细胞方向分化的细胞。该部分结果说明，所建立的类器官不仅能够生长，还在组织学和分子标志物层面保持了结肠来源特征。
2.3. Comparative Assessment Between Organoids on the Microfluidic Chip and on the Standard Culture Plates
在额外培养1周后，研究人员将类器官解离并分别接种至微流控芯片和常规培养板，以动态与静态体系平行比较。明场显微镜观察显示，芯片和培养板中的类器官在形态学上总体相似；肿瘤类器官周围可见更多小型类器官，且形态较不规则。结果表明，芯片培养在不降低培养效率的前提下，可与传统培养板一样有效地维持类器官生长。同时，由于芯片提供连续培养基供应和更稳定的实验条件，其在生理相关性方面优于静态培养体系。
2.4. Performance Evaluation of Therapies Using Bright-Field Microscopy
为评估平台在药物测试中的应用，研究人员在芯片中给予5-FU与奥沙利铂联合处理，设置3种条件：A组为0 μM + 0 μM，B组为10 μM + 10 μM，C组为100 μM + 100 μM，处理4 d后通过类器官直径变化评价疗效。非肿瘤类器官在芯片中接受低浓度药物后总体结构得以保留，仅有轻度尺寸下降，而高浓度则引起结构崩解；培养板中的非肿瘤类器官表现出类似趋势，在100 μM条件下出现完全细胞解体。肿瘤类器官在芯片中无药条件下显著增长，提示其具有较强增殖能力；10 μM低浓度下仍可见轻度生长，说明该剂量不足以明显抑制肿瘤增殖；而100 μM高浓度处理后则出现显著缩小和活性下降，显示出明确细胞毒性。培养板中的肿瘤类器官也呈现相似规律：无药条件下显著生长，低浓度下增殖受抑，高浓度下完全解体。通过类器官处理前后直径相对变化百分比计算，定量结果与显微镜观察一致。该部分结果说明，该模型能够分辨不同药物浓度对肿瘤与非肿瘤类器官的差异化影响，并揭示明确的剂量依赖性治疗反应。
2.5. Performance Analysis of Therapies with Fluorescence Biomarkers
在药物处理后，研究人员进一步采用免疫荧光进行功能性验证，使用Hoechst标记细胞核、CK20标记细胞骨架结构、Ki-67标记分裂细胞核。未处理组类器官中可见较多Ki-67阳性细胞核，提示活跃增殖；10 μM低浓度给药后，分裂细胞核数量明显减少但仍有残留；100 μM高浓度给药后，类器官结构破坏明显，CK20绿色信号呈弥散样分布，同时基本不见Ki-67红色信号，且可见更小的蓝色核样碎片。芯片和培养板中的结果总体一致。该结果表明，药物浓度升高与分裂细胞核数量逐步下降相关，证实5-FU与奥沙利铂联用对细胞增殖具有浓度依赖性抑制作用，也进一步支持微流控芯片平台可用于结肠癌治疗研究中的精细化药效评价。
在讨论部分，研究人员指出，本研究成功开发并验证了基于患者来源肿瘤和非肿瘤结肠类器官的结肠癌类器官芯片模型，证明该系统可用于药物测试和生物标志物检测。与传统培养板相比，微流控芯片通过持续培养基灌流，更好地模拟了体内营养供给、代谢废物清除和持续药物暴露等肿瘤微环境特征，从而克服了静态培养的关键局限。值得注意的是，芯片流速经过调整，使其与24孔板中每两天换液量相匹配，因此两种体系之间可以进行直接比较。在这一条件下，芯片中培养的类器官保持了结构完整性和活性，说明动态微环境未带来额外培养应激。
研究同时指出，所采用的5-FU和奥沙利铂浓度参考了既往结直肠癌患者来源类器官研究方案，其中10 μM大致处于患者最大血浆浓度范围附近，而100 μM则属于体外研究中用于评估高剂量细胞反应的暴露水平。虽然培养基中含有促进增殖的生长因子，但免疫荧光结果显示，随着药物浓度升高，Ki-67阳性细胞核显著减少甚至消失，说明药物能够有效抑制细胞分裂。总体而言，作者认为，该研究结合了肿瘤生物学、药物反应评价和微流控平台技术，具有明确的分子医学和转化研究价值。
研究结论部分可译为：
本研究为将患者来源结直肠癌类器官成功整合到动态微流控器官芯片平台中提供了重要的概念验证。该系统能够在连续灌流条件下维持类器官活性与结构，并可通过形态学分析和增殖分析对化疗反应进行可重复、剂量依赖性的评价。该微流控系统还通过免疫荧光分析显示，随着药物浓度升高，细胞分裂减少，具体表现为类器官细胞核中Ki-67表达下降。芯片培养与传统培养板培养结果的一致性验证了该平台的可靠性，而动态环境则增强了其生理相关性。尽管仍需在更大患者队列中进一步验证，并需要将该体外模型与患者体内实际药物浓度进行比较，但该工作代表着朝向更具预测性的体外系统以及结直肠癌个体化治疗未来应用迈出的有前景一步。
