羊草（Leymus chinensis）环境胁迫条件下RT-qPCR内参基因的筛选

《International Journal of Molecular Sciences》：Screening of Reference Gene for RT-qPCR in Leymus chinensis During Environmental Stress Conditions

　　

可靠的内参基因对于确保基于实时定量PCR（RT-qPCR）的基因表达分析的准确性至关重要，特别是在环境胁迫条件下。在本研究中，研究人员以羊草（Leymus chinensis）为实验材料，选择了8个候选内参基因——α-微管蛋白（TUA）、β-微管蛋白（TUB）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、延伸因子1-α（EF1α）、¹⁸S核糖体RNA（¹⁸S rRNA）、腺苷酸环化酶相关蛋白（CAP）、腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）和肌动蛋白（ACT）——评估它们在冷、干旱、热、NaCl、高pH、创伤、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）处理下的表达稳定性。研究人员首先评估了引物特异性和扩增效率，然后使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder对候选基因进行了综合分析。结果表明，所有引物的扩增效率在95.0%至107.2%之间，候选基因的Ct值在17.31至30.99之间。使用RefFinder的综合分析显示，ACTIN在ABA和NaCl处理下是最稳定的基因，EF1α在热和创伤处理下，CAP在JA和高pH处理下，APRT在冷处理下，TUB在干旱处理下。geNorm分析表明，每个处理条件下两个内参基因足以进行准确归一化。通过LcbZIP46、LcWRKY5和LcFIN1的表达水平验证进一步证实了筛选结果的可靠性。本研究为环境胁迫条件下羊草（Leymus chinensis）基于RT-qPCR的表达分析提供了稳定的内参基因体系。

**羊草环境胁迫条件下RT-qPCR内参基因的筛选——论文解读**

**研究背景与问题**

羊草（*Leymus chinensis*）是中国北方天然草原和盐碱草甸的优势建群种，兼具高蛋白优质牧草和生态修复先锋物种的双重功能。然而，盐碱、干旱、极端温度等环境胁迫严重抑制其种子萌发、幼苗生长和生物量积累，制约了其草地恢复与畜牧生产中的应用。在复杂胁迫条件下，解析羊草胁迫适应的分子机制，特别是通过基因表达谱分析鉴定关键候选基因，已成为育种和生态修复研究的核心。实时定量PCR（RT-qPCR）以其高灵敏度和特异性成为基因表达分析的主流技术，但其结果的可靠性高度依赖于内参基因（reference gene）的表达稳定性。理想的内参基因应在不同胁迫条件下保持稳定，但现有研究显示，传统管家基因（如ACTIN、GAPDH等）并非在所有物种、组织或胁迫条件下均稳定表达。羊草中虽已有无机磷胁迫下的内参基因筛选，但盐、旱、冷等非生物胁迫下系统评估的缺失，可能导致现有基因表达数据及调控网络的可信度不足。因此，开展羊草在多种环境胁迫条件下的内参基因筛选，是确保后续基因功能验证和耐逆育种研究可靠性的前提。

**研究内容与结论**

本研究以羊草品种吉生4号为材料，选取8个候选内参基因（α-微管蛋白TUA、β-微管蛋白TUB、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、延伸因子1-α EF1α、¹⁸S核糖体RNA ¹⁸S rRNA、腺苷酸环化酶相关蛋白CAP、腺嘌呤磷酸核糖转移酶APRT、肌动蛋白ACT），在冷、干旱、热、NaCl、高pH、创伤、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）共8种处理下，系统评估了其表达稳定性。通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder四种算法综合分析，筛选出各处理下最稳定的单基因和最优双基因组合。结果表明，不同胁迫条件下内参基因的稳定性具有高度特异性：ACT在ABA和NaCl处理下最稳定，EF1α在热和创伤处理下最稳定，CAP在JA和高pH处理下最稳定，APRT在冷处理下最稳定，TUB在干旱处理下最稳定。geNorm配对变异分析显示，多数处理下V_2/3值低于0.15，表明两个内参基因即可满足准确归一化需求。通过目标基因LcbZIP46、LcWRKY5和LcFIN1的表达验证，证实了使用稳定内参基因可获得可靠表达趋势，而使用不稳定内参基因则导致偏差。该研究为羊草环境胁迫下的RT-qPCR基因表达分析提供了稳定的内参基因选择框架，论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

**关键技术方法**

样本来源：羊草品种吉生4号，种子育苗后30天苗龄。主要技术方法：1）RT-qPCR采用SYBR Green荧光染料法，对8种处理（冷、干旱、热、NaCl、高pH、创伤、ABA、JA）下不同时间点的全株样品进行基因表达检测；2）通过熔解曲线和标准曲线评估引物特异性和扩增效率；3）利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder四种算法，基于Ct值（循环阈值）计算候选基因的表达稳定性值（M值、标准差等），进行综合排名；4）通过LcbZIP46、LcWRKY5和LcFIN1三个胁迫响应转录因子的表达水平验证，比较最稳定单基因、最优双基因组合和最不稳定基因的归一化效果。

**研究结果**

**候选内参基因的选择**：从先前文献报道中筛选出8个在羊草中具有潜在应用价值的候选内参基因，包括TUA、TUB、GAPDH、EF1α、¹⁸S rRNA、CAP、APRT和ACT。

**扩增特异性、扩增效率与表达谱分析**：所有候选基因的RT-qPCR熔解曲线均显示单一峰，表明引物扩增特异性良好。扩增效率范围为95.0%至107.2%，均在可接受区间内。Ct值分析显示，GAPDH的平均Ct值最低（19.68），表达丰度最高；¹⁸S rRNA的平均Ct值最高（25.11），表达丰度相对较低。不同处理间Ct值分布差异表明需进一步借助稳定性算法进行评估。

**表达稳定性分析**：采用四种算法分别评估。geNorm分析显示，所有候选基因的M值均低于1.5，符合推荐阈值；配对变异V_n/n+1分析表明，除干旱处理外，V_2/3值均小于0.15，即两个内参基因足以用于归一化。NormFinder分析结果与geNorm略有差异，但基本一致，均识别出不稳定基因。BestKeeper分析基于Ct值的标准差（SD）和变异系数（CV）进行排名，结果与NormFinder在多数处理下一致。RefFinder综合排名作为最终依据：ABA和NaCl处理下ACT最稳定；热和创伤处理下EF1α最稳定；JA和高pH处理下CAP最稳定；冷处理下APRT最稳定；干旱处理下TUB最稳定。

**选定内参基因的验证**：以LcbZIP46、LcWRKY5和LcFIN1为验证基因，分别采用最稳定单基因、最优双基因组合和最不稳定单基因进行归一化。结果显示，使用最稳定内参基因或最优组合时，三个目标基因的表达趋势一致，且与已有文献报道相符（如LcFIN1在冷胁迫下显著诱导）；而使用最不稳定内参基因则导致表达趋势出现明显偏差，甚至相反。例如，LcbZIP46在冷处理下以APRT或APRT+TUB归一化时呈上调，而以¹⁸S rRNA归一化时呈下调。该结果证实了本筛选方法的可靠性。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究系统评估了羊草在8种处理下8个候选内参基因的稳定性，证实了内参基因稳定性具有高度胁迫特异性。不同算法结果存在差异属于正常现象，因算法原理不同（geNorm基于配对变异，NormFinder兼顾组内和组间变异，BestKeeper基于标准差，RefFinder整合多算法）。推荐的双基因组合（如CAP/EF1α用于ABA和干旱处理、APRT/TUB用于冷处理、ACTIN/EF1α用于热处理等）可有效降低单一基因表达波动的影响，提高归一化准确性。通过验证基因的表达分析，进一步支持了所筛选内参基因在胁迫响应研究中的适用性。

结论部分翻译如下：总之，本研究系统评估了羊草中8个候选内参基因在6种非生物胁迫和2种激素处理下的表达稳定性，为每种特定处理条件筛选出了合适的单基因和最优双基因归一化组合。结果表明，羊草中内参基因的稳定性具有高度条件依赖性。因此，针对不同胁迫条件选择恰当的稳定内参基因——特别是优先使用双基因组合进行归一化——对于提高RT-qPCR定量的准确性至关重要。基于geNorm分析，推荐的双基因归一化组合为：ABA和干旱处理用CAP/EF1α，冷胁迫用APRT/TUB，热胁迫用ACTIN/EF1α，JA和高pH处理用ACTIN/CAP，NaCl胁迫用ACTIN/GAPDH，创伤处理用ACTIN/APRT。根据RefFinder综合排名，推荐的单一内参基因为：ABA和NaCl处理用ACTIN，冷胁迫用APRT，干旱胁迫用TUB，热胁迫和创伤用EF1α，JA和高pH处理用CAP。总体而言，本研究为暴露于非生物胁迫和植物激素处理的羊草中的基因表达分析提供了一个可靠的内参基因选择框架。