《mAbs》：A NANOBODY molecule that blocks MerTK ectodomain cleavage in vitro and in vivo
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膜受体 MerTK 对炎症消退至关重要，因此具有药理学意义。MerTK 功能受到其胞外域蛋白水解裂解的抑制，导致可溶性 Mer (sMer) 的形成。研究人员在此描述了纳米抗体 (NANOBODY) 分子 A0445046C08 及其半衰期延长版本 A0445
膜受体 MerTK 对炎症消退至关重要，因此具有药理学意义。MerTK 功能受到其胞外域蛋白水解裂解的抑制，导致可溶性 Mer (sMer) 的形成。研究人员在此描述了纳米抗体 (NANOBODY) 分子 A0445046C08 及其半衰期延长版本 A044500050。两者均选择性结合 MerTK，并在原代巨噬细胞中阻断脂多糖 (LPS) 诱导的 MerTK 裂解，而不影响 MerTK 的配体结合或激酶活性。A044500050 降低了无菌性腹膜炎小鼠模型腹腔灌洗液中酵母聚糖 (Zymosan) 诱导的 sMer 水平。该研究表明，可以产生选择性抑制胞外域脱落 (ectodomain shedding) 的纳米抗体 (NANOBODY) 分子，并概述了一种针对异常裂解起致病作用的膜蛋白的新型药理学方法。
**研究背景与问题**
MerTK（MER proto-oncogene tyrosine kinase，原癌基因酪氨酸蛋白激酶Mer）是TAM（Tyro3-Axl-Mer）受体酪氨酸激酶家族成员，在巨噬细胞中高表达，对吞噬凋亡细胞（efferocytosis）至关重要，从而促进炎症消退。MerTK功能受其胞外域（ECD）的蛋白水解裂解（即胞外域脱落，ectodomain shedding）抑制，该裂解由金属蛋白酶ADAM17（a disintegrin and metalloproteinase 17）介导，产生可溶性Mer（sMer）。sMer作为诱饵受体，其水平升高与多种炎症性疾病相关。直接抑制ADAM17虽可阻止裂解，但因该蛋白酶底物广泛，易导致脱靶副作用。因此，开发特异性阻断MerTK裂解的策略具有重要治疗意义。
**研究人员开展的研究**
研究人员通过免疫羊驼（camelid）获得针对人MerTK胞外域的纳米抗体（NANOBODY），筛选出高亲和力、选择性结合MerTK且不干扰其配体Gas6（growth arrest-specific protein 6）结合或激酶活性的单克隆纳米抗体A0445046C08，并构建其半衰期延长版本A044500050（融合白蛋白结合纳米抗体）。通过体外原代巨噬细胞实验和体内人源化小鼠模型验证其阻断MerTK裂解的效果。该研究发表在《mAbs》。
**关键技术方法**
研究人员采用骆驼科动物免疫（针对人MerTK胞外域DNA及蛋白）构建噬菌体展示文库，筛选获得纳米抗体；通过流式细胞术（flow cytometry）检测与表达人/食蟹猴MerTK的CHO细胞及原代巨噬细胞的结合；利用表面等离子共振（SPR）测定亲和力；酶联免疫吸附试验（ELISA）评估对TAM家族其他成员的交叉反应及Gas6竞争；HTRF（均相时间分辨荧光）分析Erk1/2磷酸化以评估激酶活性；原代巨噬细胞来自比利时红十字会及BioIVT公司（人单核细胞分离后分化）；体内模型使用人源化MERTK/GAS6双敲入小鼠（C57BL/6背景），通过酵母聚糖（Zymosan）诱导无菌性腹膜炎检测腹腔灌洗液中sMer水平。
**研究结果**
**选择性与结合特性**：A0445046C08高亲和力结合人及食蟹猴MerTK（KD<23 pm和<40 pm），但不结合TAM家族其他成员Tyro3和Axl，且不干扰Gas6与MerTK的结合。A044500050保留类似结合特性，但亲和力略低（EC50值较高）。
**不激活受体信号**：与Gas6不同，A0445046C08和A044500050均不诱导原代巨噬细胞中Erk1/2磷酸化，表明其结合不激活MerTK激酶活性。双价纳米抗体A044500010（含两个MerTK结合模块）激活Erk1/2磷酸化并降低MerTK表面表达，因此被放弃后续研究。
**阻断MerTK裂解**：在LPS（脂多糖）刺激的原代人巨噬细胞中，A0445046C08和A044500050均以浓度依赖方式阻止MerTK表面表达下降，并降低细胞上清中sMer水平，其效果与ADAM17抑制剂TAPI-1相当。A044500050不直接抑制ADAM17酶活性，说明其作用是通过与MerTK结合实现的。
**体内验证**：在人源化MERTK/GAS6双敲入小鼠中，酵母聚糖诱导的腹腔灌洗液sMer水平升高；A044500050（3mg/kg和10mg/kg皮下注射）剂量依赖性地降低sMer水平，证实其体内阻断MerTK裂解的能力。
**讨论与结论**
讨论部分强调，该研究成功实现了特异性阻断MerTK胞外域脱落，而不干扰其生理配体结合和激酶活性，这得益于纳米抗体对MerTK的高选择性且不影响ADAM17活性。双价纳米抗体因诱导受体二聚化和内吞而具有激动作用，因此舍弃。未来需明确纳米抗体是通过空间位阻还是变构调节抑制裂解。半衰期延长版本A044500050为研究MerTK裂解在疾病中的作用提供了有力工具。该纳米抗体策略为靶向其他膜蛋白的异常裂解提供了新范式。
研究结论：总之，研究人员的这项工作建立了纳米抗体介导的胞外域脱落抑制的概念验证，可扩展到其他治疗相关的膜蛋白，为异常蛋白裂解起致病作用的疾病开辟精准医学方法的新途径。
