基于非化学计量比巯基–烯反应构建多层聚乙二醇水凝胶的工程化方法

《ACS Applied Polymer Materials》：Engineering Multilayer Poly(ethylene glycol) Hydrogels via Off-Stoichiometry Thiol–Ene Chemistry

　　

具有空间可控机械性能与功能特性的多层水凝胶正变得愈发重要，但其应用价值常受制于制备挑战，例如层间界面黏附较弱，以及对细胞毒性光引发剂和紫外（UV）照射的依赖。本研究提出了一种简单、稳健且无需光引发剂的方法，利用非化学计量比巯基–烯（OSTE）Michael加成化学构建多层聚乙二醇（PEG）水凝胶。通过有意采用交替的富巯基和富乙烯基砜PEG配方，层间界面保留了残余官能团，并在随后与相邻层形成共价键，从而在无需UV照射、光引发剂或黏合剂的条件下实现强界面黏附。所得水凝胶表现出快速且可调的凝胶化行为（1–5 min），并可通过改变聚合物浓度（5–10 wt %）和巯基–烯比例（0.6–1.6）获得约0.5–6 kPa范围内的力学性能。Ellman测定法证实存在依赖于化学计量比的未反应巯基，从而验证了所提出的界面键合机制。剥离测试显示界面黏附强度高，破坏发生于材料本体内部而非界面处。纳米压痕进一步揭示了多层构建体中空间限定的刚度分布，证实其能够实现精确的力学分区。该类水凝胶根据配方不同呈现可调的溶胀行为和降解特征。此外，所有单层及多层水凝胶均维持较高细胞相容性（>90% NIH/3T3小鼠成纤维细胞存活率），且不受聚合物浓度、巯基–烯比例或分层结构影响。海藻酸盐微粒的引入提供了另一种调控水凝胶性质的策略，在保持结构完整性的同时显著降低溶胀并提高刚度。总体而言，这些结果建立了一个用于构建异质性水凝胶结构的平台，可实现空间可控的材料性质、生物功能性与相容性特征，使其适用于生物医学应用。

该论文发表于《ACS Applied Polymer Materials》，围绕多层聚乙二醇（PEG）水凝胶的构建策略展开，核心目标是在避免紫外（UV）照射、光引发剂和外加黏合剂的前提下，实现层间稳定共价连接以及空间可控的力学与功能分区。水凝胶因其高含水、柔软、黏弹性和组织仿生特征，在药物递送、组织工程、生物传感和创面修复等方向具有广泛应用前景。然而，传统水凝胶通常结构均一，难以模拟天然组织在刚度、降解速率和生物分子释放方面的空间异质性。多层水凝胶因可通过不同层赋予不同功能而受到关注，但其制备长期面临关键难题：不同组成层之间常出现界面黏附不足，进而导致分层、力学完整性下降及传质/释放行为改变。现有PEG多层体系常依赖光聚合逐层固化，虽然能够实现较快成胶和一定空间控制，但对UV和光引发剂的依赖增加了工艺复杂性，也带来潜在细胞相容性问题。因此，开发一种温和、无光引发、可稳定构筑多层界面的新方法具有明确必要性。

研究人员采用四臂PEG乙烯基砜（PEG-VS）与四臂PEG巯基（PEG-SH）构建非化学计量比巯基–烯（OSTE）Michael加成体系，通过交替设置富巯基层与富乙烯基砜层，在层间保留未反应官能团，并使这些官能团在后续铺层过程中发生界面共价反应，从而实现强层间键合。研究结果表明，该体系能够在1–5 min内快速凝胶化，并通过调节聚合物浓度与巯基–烯比例实现广泛的力学调控；层间黏附强度高于材料本体强度，剥离过程中破坏主要发生在体相内部；水凝胶还表现出可调溶胀与降解特性，并维持较高细胞相容性。进一步地，引入海藻酸盐微粒后，体系的溶胀被抑制，刚度得到提高，提示该平台具有进一步扩展为复合功能构建体的潜力。该研究的重要意义在于，为多层异质PEG水凝胶提供了一种无需光化学介入的制备路线，并证明通过化学计量失衡设计即可兼顾界面完整性、空间力学分区及生物医学适用性。

在技术方法上，研究人员首先制备不同聚合物浓度（5、7.5、10 wt %）和不同巯基–烯比例（0.6、0.75、1.3、1.6）的单层与多层PEG-SH/PEG-VS水凝胶，并以逐层堆叠方式获得交替富巯基/富乙烯基砜的层状结构。随后采用流变学（rheology）评估凝胶化动力学与储能模量G′，采用溶胀实验和水解/氧化降解实验评价稳定性；利用Ellman试剂测定残余巯基，T型剥离（T-peel）测试评价界面黏附，纳米压痕（nanoindentation）测定空间刚度分布，扫描电子显微镜（SEM）观察冻干后层状结构；最后以NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞进行CCK-8急性细胞毒性检测，并考察海藻酸盐微粒掺入后的材料变化。

在“Gelation Kinetics and Mechanical Properties”部分，研究人员通过流变测试发现，所有配方在混合后立即开始网络形成，凝胶点位于1–5 min，且G′均高于G″，说明体系以弹性行为为主并成功成胶。聚合物浓度升高可显著缩短凝胶时间，其中10 wt %配方最快，5 wt %最慢；相比之下，巯基–烯比例变化对凝胶时间影响有限。力学方面，储能模量随PEG浓度增加而升高，表明更高前驱体浓度带来更高交联密度。研究还指出，理论上化学计量平衡最有利于网络连通，但在非化学计量体系中出现了明显的不对称性：富乙烯基砜配方的模量高于对应的富巯基配方。研究人员据此总结，富乙烯基砜条件下更多限制性巯基可形成有效网络连接，而富巯基条件下则更易因副反应和网络缺陷导致有效交联度下降。

在“Equilibrium Swelling and Degradation Studies”部分，研究人员系统比较了不同配方的平衡溶胀与降解行为。结果显示，在1.3和1.6比例条件下，随着PEG浓度由5 wt %增至10 wt %，溶胀比显著下降，说明更高交联密度限制了吸水；而在0.6和0.75比例下，PEG浓度变化对溶胀比影响不显著。研究人员认为，这种差异与富巯基体系更高亲水性有关。水解降解实验表明，富巯基配方降解更快，在90 d内可出现更高质量损失，而富乙烯基砜配方更稳定。这与前述力学结果一致，提示富巯基体系中悬垂链、分子内环及网络缺陷更多，从而降低稳定性。氧化降解实验则显示，所有配方在H₂O₂/CoCl₂体系中均快速降解并于4 h内完全溶解，说明PEG醚键骨架易受氧化断裂影响，但不同配方之间差异相对有限。

在“Determination of Unreacted Thiol Groups”部分，研究人员利用Ellman法定量残余巯基。结果显示，0.6和0.75配方几乎无412 nm吸收，而1.3和1.6配方吸收明显，且随聚合物浓度增加而增强；其中1.6配方的吸收始终高于1.3配方50%以上。该结果直接证明富巯基体系中保留了更多可及的未反应巯基，为后续与相邻富乙烯基砜层发生界面共价键合提供了实验支持，也验证了多层构筑策略的化学基础。

在“Strength of Adhesion─(Peel Test)”部分，研究人员采用T型剥离测试评价双层水凝胶的界面黏附性能。不同聚合物浓度双层凝胶在剥离过程中均未发生典型界面脱层，而是最终出现整体撕裂。研究人员据此认定，层间界面结合强度高于水凝胶本体抗撕裂强度，即失效模式为体相破坏而非界面失效。这一结果是该研究最关键的证明之一，表明非化学计量比设计确实成功建立了强共价界面。

在“Stiffness Distribution and Adhesion Stability in Layered Gel”部分，研究人员通过纳米压痕测得多层构建体内部存在清晰的空间刚度分布。热图显示，不同层的杨氏模量可随巯基–烯比例和PEG浓度变化而精确调控，其中0.6比例层最硬，1.6比例层最软，这与单层流变学结果保持一致。进一步通过冻干、扫描电子显微镜观察和重新溶胀测试发现，各层在经历冻结、冻干和再水化后仍保持完整，无明显分离。此外，研究人员构建了更复杂的三维层状结构，并在PBS中保持良好完整性，进一步证明该方法的界面稳定性与结构可扩展性。

在“In Vitro Cytotoxicity Studies”部分，研究人员使用NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞进行CCK-8检测，评估不同PEG浓度、不同巯基–烯比例以及单双层构型对急性细胞毒性的影响。所有实验组细胞存活率均高于90%，且组间无显著差异。结果表明，无论是交联密度变化、残余官能团差异，还是层间界面的存在，均未在24 h暴露条件下导致明显细胞毒性。研究人员同时指出，这些结果主要反映短期细胞相容性，而PEG网络本身具有生物惰性，不天然支持细胞黏附，因此若面向长期细胞培养或组织工程应用，仍需进一步引入RGD等生物活性配体。

在“Effects of Microparticles Embedded in the Hydrogel Matrix”部分，研究人员将海藻酸盐微粒掺入PEG巯基–烯水凝胶，考察其对物理性质的调控作用。结果显示，加入微粒后，各PEG浓度和巯基–烯比例下的溶胀比均显著降低，且在较高比例条件下更为明显。与此同时，储能模量在部分条件下升高，尤其是7.5和10 wt %体系中提升更显著。研究人员据此认为，海藻酸盐微粒作为物理填料减少了网络中可容纳水分的空间，并促进形成更致密、更强韧的复合水凝胶。这说明除化学计量比和聚合物浓度外，微粒掺入也是进一步定制材料力学和保水性能的有效手段。

综合讨论部分可概括为：该研究围绕“界面如何在温和条件下稳定形成”这一核心问题，证明了非化学计量比巯基–烯Michael加成不仅能够保留界面反应位点，还能通过交替铺层使这些位点在相邻层间形成共价键，从而获得强层间黏附。与此同时，化学计量失衡还为调控力学性能、溶胀行为和降解速率提供了参数空间。富乙烯基砜和富巯基体系在网络结构上的不对称性，解释了它们在刚度与稳定性上的显著差异。细胞相容性实验与微粒复合结果则表明，该平台既具备基础生物医学适用性，也具有进一步功能扩展的潜力。因此，该研究建立的是一个兼具工艺简化、空间可编程和界面可靠性的多层PEG水凝胶构建框架。

研究结论部分可译为：研究人员开发了一种基于非化学计量比巯基–烯化学的多层PEG水凝胶制备方法，由此获得的相邻独立层无需UV光、光引发剂或外部黏合剂即可实现键合。所得水凝胶表现出可调的凝胶化时间、刚度、溶胀和降解特性，同时保持了层间强黏附。力学测试证实，界面键合强度高于材料本体本身。细胞相容性研究显示，所有配方在暴露24 h后均保持较高的NIH/3T3成纤维细胞存活率。研究人员还观察到，微粒的加入为调控整体水凝胶溶胀和刚度提供了另一种手段。本文所述逐层构建方法能够制备具有空间限定材料性质且保持界面完整性的复合水凝胶结构。这类结构适用于需要对功能组分进行空间分隔的应用场景，包括多重传感以及具有独立可调时间释放曲线的多组分控释系统。