用于同时定量商业Centella asiatica产品中六种三萜（含异构体分离）的验证HPLC方法

《ACS Omega》：Validated HPLC Method for Simultaneous Quantification of Six Triterpenes with Isomer Separation in Commercial Centella asiatica Products

　　

Centella asiatica（积雪草）含有具有重要药理活性的五环三萜，通常用作草药制剂质量评价的化学标记物。然而，由于某些分析物结构上具有相关性且在色谱上难以分离，准确定量仍然具有挑战性。在本研究中，研究人员开发了一种经过验证的高效液相色谱（HPLC）方法，用于同时分离和定量C. asiatica产品中的六种主要三萜，即积雪草苷B（ASB）、羟基积雪草苷（MS）、积雪草苷（AS）、 terminolic acid（TA）、羟基积雪草酸（MA）和积雪草酸（AA）。由于β-环糊精（β-CD）价格低廉，因此被选作流动相改性剂，以改善密切相关三萜异构体的识别。在使用含有β-CD的乙腈和0.2% (v/v)磷酸进行梯度洗脱的ACE Excel C₁₈色谱柱（5 μm，4.6 × 250 mm）上，在总色谱运行时间为25分钟的情况下，15分钟内实现了两对关键异构体（ASB/MS和TA/MA）的基线分离。以往基于CD辅助的HPLC方法多侧重于五种三萜的分离或仅挑选特定的异构体对，与之不同的是，本研究的方法首次实现了六种三萜的同时识别和定量，包括ASB/MS和TA/MA两对异构体。该方法根据ICH、Eurachem和AOAC指南进行了全面验证。该方法显示出良好的线性、可接受的检测限和定量限、令人满意的重复性和中间精密度、合适的回收率以及良好的选择性。该方法已成功应用于商业C. asiatica产品，证明了其在草药原料和制剂的常规质量控制和植物化学评估方面的适用性。使用分析绿色度评价（AGREE）指标得出的得分为0.50，表明具有中等的绿色度；而使用Mosaic-White Analytical Chemistry（WAC）工具进行的整体评估给出的白度指数为68.6，表明基于分析可靠性、环境影响和实际适用性，该方法具有令人满意的整体质量。该方法为同时测定C. asiatica基质中的六种三萜提供了一种实用且可靠的途径。

积雪草是一种长期应用于传统医学的多年生草本植物，其提取物被广泛用于药品、营养品和化妆品中。积雪草的药效归因于其富含三萜类化合物。在这些化合物中，积雪草酸（AA）、羟基积雪草酸（MA）、积雪草苷（AS）和羟基积雪草苷（MS）常被用作评价积雪草产品质量的标记物。除了这些主要化合物外，积雪草还含有结构相关的三萜，包括积雪草苷B（ASB）和 terminolic acid（TA）。从结构上讲，这些化合物分为熊烷型（ursane-type，如AS、MS、AA、MA）和齐墩果烷型（oleanane-type，如ASB、TA）。由于熊烷型和齐墩果烷型骨架在五环骨架内的甲基取代模式存在差异，准确区分这些三萜对于色谱分析、产品标准化和质量控制至关重要。然而，这些化合物的结构相似性和共洗脱行为使得准确定量极具挑战性。此前，同时分离这六种三萜的常规HPLC方法运行时间往往超过60分钟，或者未能同时解决ASB/MS和TA/MA异构体对的基线分离问题。为此，研究人员开展了一项新的研究，旨在开发一种快速且可靠的HPLC方法，以在单次色谱运行中同时分离并定量这六种三萜及相关异构体，丰富分析检测手段。该研究成果发表在《ACS Omega》上，为商业积雪草产品的质量控制提供了一种实用的分析工具。

在这项研究中，研究人员使用了配备二极管阵列检测器（DAD）的Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱系统，在ACE Excel C₁₈色谱柱上进行梯度洗脱分离。主要技术关键在于选用β-环糊精（β-CD）作为廉价流动相添加剂，利用其主客体相互作用来改善结构相似异构体的识别。整个方法依据ICH、Eurachem和AOAC等指南进行了全面验证，并利用AGREE和Mosaic-WAC工具分别进行了环境绿色度和整体质量评估。样本队列来源于泰国在线平台和零售店购买的8种商业积雪草产品（A-H品牌）。

开发和验证用于分离六种三萜及其异构体对的HPLC方法
通过评估含有4 mM β-CD的C₁₈色谱柱，在优化的梯度洗脱下，六种标准三萜均实现了基线分离（R > 1.5）。所有分析物在15分钟内洗脱完毕，总运行时间为25分钟。洗脱顺序和保留时间分别为ASB（5.0 min）、MS（5.6 min）、AS（6.4 min）、TA（10.3 min）、MA（11.3 min）和AA（13.9 min）。相邻色谱峰之间的分离度值良好。结果表明，β-CD与梯度洗脱相结合，不仅改善了ASB/MS和TA/MA异构体对的分离度，还缩短了分析物在固定相中的保留时间。与以往使用γ-CD的方法相比，本研究建立的方法将分析范围从五种扩展到六种，包括了两对具有挑战性的异构体，且运行时间更短。

HPLC方法的验证
根据ICH Q2(R2)指南对HPLC方法进行验证以评估其性能。线性分析表明所有分析物的r²大于0.999，显示出良好的线性关系。与传统方法相比，本研究提供的线性动态范围更宽（20-20,000 ng），可灵活定量浓度变化较大的样品。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1-20 ng和4-62 ng。经计算，霍维茨比率均小于2，显示重复性和中间精密度良好，且均符合AOAC指南的接受标准。在准确度评估中，三个浓度下的加标回收率在84%-107%之间。在选择性测试中，通过方差分析（ANOVA）表明样品基质对六种三萜的检测没有显著干扰，方法选择性优异。综上，该方法在复杂基质中具有可靠的定量能力。

商业积雪草产品中六种三萜的定量
研究人员将该方法成功应用于泰国市场上的八种商业积雪草产品。结果显示，不同品牌产品的总三萜含量差异巨大，范围约为2.8至71.8 mg/g干提取物。某些品牌（如B）未检测到TA、MA和AA，而品牌D中AA的浓度低于LOQ。片剂形式的产品由于包衣难以去除或匀浆不完全，其变异系数（%CV）较高。这些含量差异和分布特征反映了原材料来源、提取工艺和配方实践的不同，说明该方法适宜评估粉末或胶囊产品，而片剂基质仍需优化提取方案。

绿色度和整体评估
利用AGREE指标评估环境可持续性，该方法总得分为0.50，呈现中等的绿色度。该方法的优势在于无需衍生化、能在单次运行中分析多种分析物且可在30°C温和条件下操作。然而，乙腈和甲醇等中等毒性有机溶剂的使用以及较长的样品前处理时间限制了其总体得分。进一步的Mosaic-WAC工具评价显示，该方法的白度指数为68.6，被认为在分析可靠性、环境影响和实际适用性之间存在良好的平衡。Mosaic-WAC的创新维度得分为0，指出未来可通过引入便携式或微型化设备进一步提升价值。

总结与结论
本研究开发并验证了一种快速且高效的HPLC方法，可在25分钟的总运行时间（15分钟洗脱）内实现六种关键三萜及其异构体对（ASB/MS和TA/MA）的基线分离。该方法采用MeCN与含β-CD的0.2%磷酸作为梯度流动相体系，并按国际协调委员会（ICH）、Eurachem和官方分析化学家协会（AOAC）指南进行了全面方法学验证，确认了其在复杂基质中定量的准确性与可靠性。对商业积雪草产品的应用分析揭示了不同品牌间总三萜含量的显著差异，凸显了标准化分析在质量控制中的重要性。AGREE评价得分0.5表明其具备中等绿色特征，Mosaic-WAC评价给出的白度指数为68.6，反映出该方法在分析性能、环境和实际应用方面取得了令人满意的综合表现。尽管仍存在对有机溶剂的依赖，但未来通过溶剂替代、系统微型化等方式有望进一步提升其可持续性。该方法为商业积雪草制剂中六种三萜的同时测定提供了稳健且经过验证的分析手段。