综述：多维红外光谱作为一种生物分析技术

《Chemical Reviews》：Multidimensional Infrared Spectroscopy as a Bioanalytical Technique

　　

自上世纪末问世以来，二维红外（2D-IR）光谱学已持续发展成为一种研究生物分子结构、动力学和分子间相互作用的成熟方法。得益于激光及相关技术的并行进步，现在可在几分钟内，使用极少量样品并在生理相关条件下获取2D-IR数据集。这一进展为2D-IR光谱学作为分析工具发挥作用打开了大门，使其能够进行表征样品的测量，并为从药物设计到生物医学诊断等领域的决策提供信息。在此，研究人员简要回顾了促成这一局面的开创性发展，随后讨论了2D-IR光谱学在分析应用方面的最新进展。研究人员考虑了2D-IR光谱学在无标记蛋白质结构测量、生物分子相互作用中的应用，以及利用2D-IR探究复杂混合物和生物组织的方法。研究人员还纳入了通过测量灵敏度和数据质量方面的进步来扩展2D-IR光谱学应用范围的策略，并强调了机器学习等新兴方法可能对2D-IR发展产生的潜在影响。最后，研究人员展望了2D-IR在成为稳健且广泛使用的生物分析工具道路上所面临的挑战和机遇。

论文主体部分内容总结如下：

**1. 引言**
自1998年首次报道以来，超快二维红外（2D-IR）光谱学取得了显著进展。该技术源于红外泵浦-红外探测光谱学，通过将泵浦过程进行频率分辨，使2D-IR光谱成为泵浦（激发）频率与探测（检测）频率的相关图。2D-IR能够时域分辨地观察分子在两个频率维度上的红外光谱响应，从而直接可视化分子振动之间的耦合（表现为光谱中的非对角峰），并获取动态信息，如振动弛豫路径和模式间的能量转移。同时，2D-IR可分离均匀和非均匀展宽机制的贡献。近年来，测量技术和设备的进步使得过去需要长时间才能获取的实验数据，现在可在几分钟内完成，且信噪比和检测灵敏度显著提高。本综述聚焦于2D-IR光谱学的分析应用，即利用2D-IR进行测量，为其他科学目标提供信息，例如指导药物设计或实现生物医学评估。尽管2D-IR仍需要相当的技术专长和昂贵设备，但其正朝着能与现有分析光谱学并驾齐驱的方向发展。本综述将重点回顾过去5-7年的进展，但不包括位点特异性探针和标记蛋白质的研究。

**2. 2D-IR方法与信息内容**
2D-IR光谱的测量涉及三个超短红外脉冲在样品中的重合。前两个脉冲用于泵浦或激发特定的振动模式，第三个脉冲作为时间延迟的探测脉冲，同时也是外差检测的本地振荡器。光谱的两个频率维度分别来自探测脉冲的光谱测量和泵浦脉冲时间延迟的傅里叶变换。样品通常为溶液，但其他样品类型和测量几何构型也日益增多。

**2.1. 光谱的一般外观**
2D-IR光谱由泵浦频率与探测频率的二维图构成，对角线上出现基态跃迁（v=0→1）的峰。由于2D-IR信号来自三阶非线性光学过程，其强度与振动模式的摩尔消光系数的二次方成正比，导致对角线峰宽略窄于吸收光谱，有助于提高峰分辨率。重要的是，2D-IR信号大小与浓度成线性关系。此外，2D-IR光谱主要由具有较大消光系数的模式主导，因此对角线基本无溶剂背景干扰，这在研究[NiFe]氢化酶等样品时尤为突出，因为其羰基和氰基伸缩振动模式在FT-IR中几乎被水的组合带掩盖，但在2D-IR中清晰可见。对角线峰还可提取动态信息，如振动寿命和分子重新取向时间，以及通过观察线形随等待时间（Tw）的变化提取光谱扩散动力学。

**2.2. 光谱的非对角区域**
非对角峰具有不同的泵浦和探测频率，其出现证实了振动模式之间的耦合，表现为正负峰对。正负峰沿探测频率轴的间隔反映了非对角非谐性，即耦合强度。通过偏振敏感性可提取耦合模式跃迁偶极矩方向之间的夹角。随着Tw变化，非对角峰因振动弛豫而演化，可能显示能量转移导致的峰振幅增加。从分析角度看，非对角区域的复杂峰模式可视为特定分子的光谱指纹，用于识别物种或解析复杂混合物中的重叠峰。2D-IR响应具有加和性，且随Tw的演化提供了额外的信息维度。

**3. 蛋白质与生物分子**
**3.1. 蛋白质的2D-IR响应**
蛋白质的结构敏感性主要源于酰胺I带（主要来自肽键C=O伸缩振动）与蛋白质主链构型的密切关系。当肽段折叠成三维二级结构元件时，C=O振子之间的耦合扩展至宏观结构，导致α-螺旋或β-折叠等二级结构特征模式。此外，残基间氢键、无序度或动态运动以及局部环境（如溶剂可及性）均会影响耦合和频率。2D-IR能够通过增强的对角峰分辨率和耦合产生的非对角特征，提供比线性光谱更丰富的结构指纹信息。本综述聚焦于无标记蛋白质2D-IR光谱学，即将整个蛋白质的酰胺I带视为结构指纹。

**3.2. 测量蛋白质结构**
利用2D-IR测定蛋白质绝对结构的动机在于其能在生理温度和溶液相下提供互补信息，并具有时间分辨能力。主要挑战在于解码2D光谱特征与蛋白质三维结构之间的联系。通过研究小肽和模型系统，研究人员阐明了β-折叠等结构的2D特征，并认识到非对角贡献的重要性，如Z形2D指纹。同时，计算模型的发展（如密度泛函理论和分子动力学模拟）使得能够从蛋白质结构预测2D-IR光谱，反之亦然。2012年，首次通过测量16种不同二级结构含量的蛋白质的酰胺I 2D-IR光谱，使用奇异值分解（SVD）分析量化了α-螺旋、β-折叠和无序结构的含量，准确度与圆二色光谱（CD）相当（误差约9%）。后续研究进一步阐明了α-螺旋长度和β-折叠尺寸对非谐性的影响，以及耦合对跃迁偶极强度的影响。2D-IR还能定量检测由配体结合等事件引起的微小结构变化，例如在钙调蛋白研究中，可检测到148个残基中仅7-8个残基的α-螺旋含量变化。近年来，贝叶斯系综精修等计算方法与实验的协同应用，以及机器学习的引入，推动了蛋白质结构研究的发展。2D-IR还被用于研究蛋白质变性过程，如胍离子对溶菌酶和α-胰凝乳蛋白酶中β-折叠的影响大于α-螺旋。此外，利用抗体锚定在等离子体表面捕获淀粉样蛋白并结合2D-IR检测结构的方法，为免疫学分析增添了结构洞察力。另一种相关技术，电子-振动-振动（EVV）2D-IR光谱学，在蛋白质鉴定和翻译后修饰检测方面显示出潜力。

**3.3. 生物分子相互作用**
2D-IR光谱学广泛用于研究生物分子间相互作用，特别是在淀粉样纤维形成领域。自动化的2D-IR光谱学能够快速观察纤维形成动力学，并在脂质囊泡存在下跟踪中间结构。多学科研究结合2D-IR与荧光分析、光散射、CD和透射电子显微镜，揭示了抑制化合物对淀粉样蛋白（如IAPP）纤维形成的抑制作用。这些研究还为治疗药物设计提供了线索，例如识别有毒中间体。过渡偶极方法（利用2D-IR对耦合结构的敏感性）被用于研究纤维聚集过程中的结构形成。2017年，2D-IR测量被扩展到组织样本，如眼晶状体中晶状体蛋白的聚集。最新进展是利用偏振增强非对角峰，以区分纤维形成过程中的不同多晶型物。这些方法已应用于其他系统，如F-肌动蛋白和环状抗生素肽Gramicidin-S。在蛋白质复合物研究中，2D-IR成功提取了异位现象和胰岛素二聚体结构信息，展示了其对分子间β-折叠形成的敏感性。在药物设计领域，2D-IR被用于研究结核病相关蛋白InhA与药物分子的结合，以及细胞因子IL-17不同亚型与药物结合后的结构动力学变化，揭示了药物结合对蛋白质指纹的影响，为药物筛选提供了潜在途径。EVV 2DIR方法也用于检测药物与蛋白质的结合，并推断结合药物分子的结构。

**3.4. 水的作用与生理样品分析**
大多数2D-IR研究使用重水（D₂O）以避免水（H₂O）的弯曲振动模式（1650 cm^-1）与酰胺I带重叠。但氘代会影响蛋白质的动力学和氢键作用。2D-IR光谱学提供了一条绕过该问题的途径，因为酰胺I带的摩尔消光系数比水弯曲模式高约两个数量级，且振动寿命更长（800 fs vs 200 fs），因此H₂O中的蛋白质信号可被分辨。此外，水的热信号可线性缩放，用于归一化不同样品。基于此，研究人员在H₂O中测量了蛋白质，包括血液血清样品中的蛋白质浓度、蛋白质-小分子相互作用，以及临床样品的分类。胰岛素纤维形成在H₂O和D₂O中的动力学存在差异。

**4. 复杂基质**
**4.1. 混合物分析**
2D-IR指纹可用于识别复杂混合物中的特定分子。例如，利用2D-IR研究共晶药物分子（如沙库巴曲缬沙坦钙）的两种结晶形式，通过羧酸根和酰胺基团的光谱揭示Ca²⁺配位结构差异，并利用光谱扩散动力学推断结构刚性差异。在食品工业中，2D-IR被用于研究牛奶蛋白与咖啡因的相互作用，尽管未发现直接相互作用，但展示了2D-IR在分离重叠光谱方面的优势。在生物矿化研究方面，2D-IR结合MD预测用于研究硅藻衍生肽R5的结构，揭示了硅化过程对肽构象的影响。对于细胞样品，2D-IR已被用于测量红细胞内血红蛋白-CO的动力学，以及利用酰胺I指纹检测和区分细菌孢子（如枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌）。在含能材料领域，2D-IR用于研究太安（PETN）和环三亚甲基三硝胺（HHTT）薄膜中的振动能量转移和弛豫机制，揭示了晶体结构对能量弛豫途径的影响。

**4.2. 生物医学应用**
生物医学样品是复杂混合物的特殊类别。2D-IR光谱学最初应用于血液血清的酰胺I带研究，能够测量最丰富蛋白质的浓度变化，并有望通过结合机器学习方法，实现对血清蛋白质组学的快速评估。2D-IR还被用于测量药物与血清蛋白的结合，通过血清白蛋白的酰胺I指纹变化，可在生理浓度下检测药物存在，灵敏度远高于直接检测药物。最直接相关的生物医学研究是使用患者血清样品进行黑色素瘤复发风险分类，机器学习结合2D-IR能够区分无转移、有转移和未来会转移的患者，AUROC值分别为0.75、0.86和0.80。此外，2D-IR被用于研究淀粉样纤维在血清中的形成，并扩展至成像研究，如对小鼠胰腺组织进行高光谱成像，通过分析酰胺I带参数（如对角峰比、非对角峰振幅和非谐性）来评估蛋白质结构随时间的变化。EVV 2DIR也被用于组织成像，如小鼠肾脏切片，通过空间映射特定交叉峰来区分不同组织成分。

**5. 分析方法开发**
**5.1. 2D-IR扩散有序光谱（2DIR-DOSY）**
为解决混合样品光谱重叠问题，2DIR-DOSY方法通过基于扩散系数（与分子大小成反比）对光谱进行分层，从而分离各组分的2D-IR光谱。该方法通过测量样品溶液与纯溶剂在微通道中平行扩散时的时变2D-IR光谱，并将其转换为扩散系数依赖的三维光谱，成功用于分离淀粉样蛋白和单体蛋白质的混合物。

**5.2. 提高2D-IR光谱的灵敏度**
目前可靠测量2D-IR光谱所需的最低酰胺单元浓度约为10 μM，远高于HPLC-MS等技术的检测限。因此，提高灵敏度是关键。主要途径包括信号增强和噪声降低。

**5.3. 表面增强**
类似于表面增强红外吸收（SEIRA），分子吸附在贵金属层上时，2D-IR响应可被显著增强。增强因子定义为(S_2DIR^surf/A_surf)/(S_2DIR^bulk/A_bulk)。通过使用金薄膜（如1 nm平均厚度）的衰减全反射（ATR）几何构型，对单层对巯基苯甲腈的增强因子可达约50；对于更厚的金层（3 nm），可激发表面等离子体，增强因子超过450。此外，利用纳米图案化表面（如金纳米天线阵列）的等离子体共振，可实现线性吸收信号高达10⁵倍的增强，三阶非线性信号高达10⁷倍的增强。介电周期性结构超表面也可实现1-2个数量级的增强，且作用距离更远（约0.5 μm），但双光子吸收可能限制其用于2D-IR。最近，研究人员构建了2D-IR免疫传感器，通过将抗体附着在等离子体金表面，捕获流动溶液中的淀粉样蛋白并测量其2D-IR光谱，实现了结构敏感的免疫分析。

**5.4. 改进的噪声降低和散射抑制方法**
对于散射样品（如纤维、多孔材料），散射光会引入不需要的贡献。通过相位循环可消除外差贡献，但散射强度贡献仍需处理。通过测量足够大负时间延迟（Tw）处的信号来扣除散射背景，可测量散射比三阶信号大20倍的样品。此外，为了校正脉冲间强度波动，可使用阵列探测器边缘像素（信号为零）的读数来估计并校正基线波动，该方法基于广义线性关系，通过相关性矩阵实现。

**6. 结合机器学习**
**6.1. 蛋白质-2D-IR分析**
机器学习方法适用于充分利用2D-IR对构象的敏感性。例如，使用支持向量机（SVM）对35种蛋白质的2D-IR光谱进行二级结构含量估计，分类和回归的均方根误差低于7%，且优于FT-IR。分析发现，对角线与高频β-折叠交叉峰之间的区域对二级结构含量最敏感。此外，神经网络被用于识别溶剂引起的2D-IR线形微小变化。最近，有研究报道了使用机器学习协议从2D-IR光谱预测Cα-Cα距离矩阵，进而通过梯度下降折叠算法获得蛋白质全构象，但训练数据基于计算光谱且展宽较小。

**6.2. 血清分析**
机器学习辅助的2D-IR已成功用于血清中蛋白质-药物结合的检测以及黑色素瘤患者血清样本的分类。由于血清样本变量众多，每项研究可能需要自己的数据图书馆和算法开发。机器学习在识别健康患者血清样本的正常蛋白质谱范围、监测个体健康变化以及实现个性化医疗方面具有潜力。

**7. 2D-IR面临的开放挑战**
**7.1. 与分离方法（如HPLC）的兼容性**
色谱与2D-IR联用可同时提供分离和结构信息，但目前2D-IR的灵敏度不足以实现这种联用。表面增强虽能提高灵敏度，但增强效应仅限于金表面极短距离内，难以应用于流动系统。

**7.2. 创建FAIR在线2D-IR数据库**
机器学习方法需要大量数据，但目前缺乏在线可用的实验2D-IR数据。建立符合FAIR原则（可发现、可访问、可互操作、可重复）的在线蛋白质-2D-IR数据库至关重要，这将促进机器学习研究，并评估实验室间光谱的可重复性。仪器多样性带来的标准化挑战可通过数据科学方法或社区标准测量集来解决。

**7.3. 向可普及的光谱仪器发展**
当前2D-IR仪器仍需要高度专业操作技能，限制了其广泛应用。短期内可能通过服务设施模式运行。长远来看，需要开发高度自动化、标准化测量和数据处理协议的仪器，使2D-IR走出激光实验室，进入制药公司、医院实验室甚至工厂。