发育中小鼠输尿管中间充质WNT信号协调上皮与间充质分化

《Cell Communication and Signaling》：Mesenchymal WNT signaling coordinates epithelial and mesenchymal differentiation in the developing murine ureter

　　

背景：小鼠输尿管的间充质与上皮原基的协调发育需要强烈的组织间通讯。既往研究已揭示，FGFR2-SHH-FOXF1-BMP4信号轴在上皮和间充质的增殖与分化程序中具有关键作用。已有报道指出，间充质原基中的经典型（β-Catenin/CTNNB1依赖性）WNT信号可通过增强增殖并促进平滑肌细胞命运、抑制外膜成纤维细胞命运而影响间充质发育。

方法：为进一步研究间充质WNT信号在输尿管早期发育中的作用，研究人员分析了Ctnnb1缺失小鼠突变体在胚胎发生期间输尿管的细胞与分子改变。通过在胚胎输尿管离体培养（explant culture）中采用药理学抑制和激活策略，评估了信号活性改变对Ctnnb1缺失输尿管分化变化的贡献。对短期抑制WNT信号的胚胎输尿管进行转录谱分析，使研究人员得以鉴定该信号通路在输尿管间充质中的一级靶标。

结果：研究显示，在缺失间充质Ctnnb1的输尿管中，间充质与上皮分化均受损。该缺陷与两类组织原基均无法激活促分化转录因子有关。上皮改变至少部分可归因于上皮原基中BMP4信号丧失以及经典型WNT信号获得。间充质WNT信号直接激活SHH-FOXF1-BMP4信号轴多个组分的转录，从而增强该模块在输尿管间充质内层区域中的活性。

结论：该研究增进了对协调早期输尿管细胞分化之信号网络的理解。间充质WNT信号不仅在间充质命运决定中发挥核心作用，还可通过增强SHH-FOXF1-BMP4信号轴并抑制上皮WNT信号来促进上皮分化。

该研究发表于《Cell Communication and Signaling》，聚焦发育中小鼠输尿管中上皮与间充质两大原基如何通过信号互作实现协同分化。输尿管作为连接肾脏与膀胱的管状器官，其正常功能依赖内侧尿路上皮与外侧平滑肌层的同步成熟。若平滑肌层收缩功能不足或尿路上皮屏障建立异常，即可导致尿液引流障碍、输尿管扩张、肾积水等病理改变，并构成先天性肾脏与尿路畸形（CAKUT）的重要组成部分。既往研究已经证明，FGFR2-SHH-FOXF1-BMP4信号模块在输尿管上皮和间充质的增殖与分化中占据枢纽位置；同时，经典型WNT信号在输尿管间充质内层活跃，并与平滑肌细胞命运建立及外膜命运限制有关。然而，间充质WNT信号如何与既有的SHH-FOXF1-BMP4模块整合、如何进一步影响上皮分化、以及其直接分子靶点为何，仍未完全阐明。因此，开展本研究的必要性在于系统解析间充质WNT信号在输尿管早期细胞分化协调中的机制位置，并厘清其对上皮与间充质双重谱系成熟的联动作用。

研究人员围绕间充质中Ctnnb1缺失模型展开分析，证明该通路缺陷并非仅造成既往已知的平滑肌分化障碍，而是同时导致出生前输尿管上皮分层与分化几乎完全失败。Ctnnb1-cKO输尿管中，尿路上皮虽仍保持上皮单层结构并保留基本黏附连接特征，但不能正常产生基底细胞（B细胞）、中间细胞（I细胞）和表层细胞（S细胞）的分化标志；与此同时，间充质中平滑肌细胞（SMCs）标志亦缺失。转录组与原位杂交结果进一步显示，多种促分化转录因子在上皮和间充质中均无法正常激活，包括与上皮分层和表层分化相关的Trp63、Pparg、Grhl3、Foxa1，以及与平滑肌程序相关的Myocd、Foxf1、Gata6等。由此，研究确立了间充质WNT信号是驱动输尿管两大组织原基同步进入分化程序的上游协调因子。

方法上，研究人员主要采用四类关键技术路径。其一，利用Tbx18^cre介导的间充质特异性Ctnnb1条件敲除小鼠，对胚胎期不同时间点输尿管进行组织学、免疫荧光和RNA原位杂交分析。其二，建立E11.5-E12.5等时期的小鼠肾/输尿管离体培养体系，通过LiCl、BIO、IWP-2、BMP4、维甲酸（RA）、BMS493、purmorphamine等药理学处理评估不同信号通路的功能。其三，对胚胎输尿管样本及短期药物处理样本进行转录组分析，包括Agilent芯片和bulk RNA-Seq，以识别差异表达基因及潜在一级靶标。其四，结合RT-qPCR与公开ChIP-Seq数据库开展体外验证和生物信息学整合分析，推断CTNNB1/LEF/TCF复合体可能直接调控的目标基因。样本来源均为小鼠胚胎输尿管及其离体培养组织。

以下为研究结果的分项总结。

Complete absence of mesenchymal and epithelial cytodifferentiation in Ctnnb1-cKO ureters at prenatal stages
研究人员首先系统评估了Ctnnb1-cKO胚胎输尿管在产前阶段的细胞分化状态。免疫荧光结果显示，E18.5突变体输尿管内层上皮仍表达CDH1、CTNNB1与CTNNG等黏附连接相关蛋白，但仅维持单层结构，提示其基本上皮属性尚存而分层程序失败。更关键的是，基底细胞标志KRT5、ΔNP63，中间/表层相关标志UPK1B、UPK2、S100A1明显缺失，表明B、I、S三类尿路上皮细胞均未正常分化。与此同时，平滑肌标志ACTA2与TAGLN缺失，提示间充质平滑肌分化亦完全受阻。E14.5和E16.0时点的分析显示，这些异常自分化启动阶段即已出现。该部分结果证明，间充质Ctnnb1缺失造成的是输尿管上皮与间充质细胞分化的广泛失效，而非局限于平滑肌层。

Mesenchymal WNT signaling is required for the expression of pro-differentiation TF genes in the epithelial and mesenchymal tissue primordium of the ureter
通过E14.5输尿管转录谱分析，研究人员发现大量转录因子基因表达发生改变。上调基因多与肾单位/输尿管芽早期程序相关，在突变体上皮中可见Sp5、Lhx1、Emx2、Pax8、Hnf1b等异常增高，提示上皮停滞于前体样状态。下调转录因子则富集于“平滑肌分化”和“上皮分化”相关过程，包括Trp63、Pparg、Foxa1、Grhl3、Myocd、Foxf1、Gata6、Gata2、Sox9、Zeb2等。原位杂交进一步确认这些关键促分化基因在Ctnnb1-cKO输尿管中丢失或显著降低。由此说明，间充质WNT信号对于上皮与间充质双侧促分化转录调控网络的建立均属必需。

Loss of mesenchymal WNT signaling affects the expression of various signaling components in the early ureter
进一步的通路分析表明，Ctnnb1缺失改变了多类信号组分表达。上皮中Wnt6、Wnt9b、Wnt10a及Rspo家族等WNT相关分子上调，Aldh1a3上升，间充质中Aldh1a2增强；而间充质中Bmp4、Fzd1、Nkd1、Shisa2等表达降低。值得注意的是，Bmp4在间充质降低而在上皮升高，反映不同组织区室内调控方向并不一致。该结果提示，间充质WNT信号丧失不仅削弱本区室内的分化支撑模块，也重塑邻近上皮信号环境。

Loss of mesenchymal WNT signaling leads to increased epithelial WNT signaling and decreased BMP4, SHH, FGF and RA signaling in the early ureter
利用Axin2、Spry1、Ptch1、Id2、Id4、Rarb、Ecm1等靶基因作为读出，研究人员追踪了多条信号通路活性变化。结果显示，对照组中Axin2局限于间充质，而突变体中间充质Axin2消失、上皮出现强烈异位表达，证明上皮经典型WNT信号异常激活。与此同时，BMP4信号靶基因Id2/Id4在上皮和间充质均进行性下降，SHH信号靶基因Ptch1与FGF信号靶基因Spry1减弱，RA通路相关Rarb和Ecm1亦下降。作者据此认为，BMP4信号下调、间充质RA信号减弱及上皮WNT信号异位激活是表型形成中较早且关键的事件，其中前两者与上皮分化失败尤其相关。

Ectopic epithelial WNT signaling disrupts epithelial stratification and differentiation in the ureter
为验证上皮WNT异位激活的作用，研究人员在野生型E12.5肾/输尿管离体培养中加入LiCl激活经典型WNT信号。培养后输尿管明显变薄，上皮保持单层，缺乏B、I、S细胞标志，而平滑肌分化仅轻度受影响。早期分子检测显示，LiCl可诱导上皮Axin2异位表达，同时削弱间充质Foxf1、Bmp4及上皮/间充质Id2表达，提示上皮WNT过度活化反过来抑制SHH-FOXF1-BMP4促分化模块。短期LiCl/BIO处理的转录谱还显示，Trp63、Foxa1、Pparg等少数上皮促分化转录因子迅速下调。该部分直接证明，异位上皮WNT信号本身足以阻断尿路上皮分层与分化。

Combined restoration of BMP4 and inhibition of epithelial WNT signaling partially improves the epithelial stratification and differentiation defects in the Ctnnb1-cKO ureter
在Ctnnb1-cKO输尿管离体培养中，单独补充BMP4不能挽救上皮缺陷，单独给予WNT拮抗剂IWP-2亦不能恢复正常分化；但BMP4与IWP-2联用后，突变体输尿管可出现双层上皮结构，基底层恢复ΔNP63/P63表达，腔面层出现弱UPK1B与S100A1信号，定量上尿管面积、P63⁺细胞比例及UPK1B⁺腔面区域均显著改善。加入RA或RA受体抑制剂BMS493虽可增加组织生长，但不能额外提升上皮分化标志。该结果说明，Ctnnb1缺失所致上皮异常至少由两部分共同驱动：BMP4信号丧失与上皮WNT信号异常升高；RA更多影响生长而非分化。

Cyto-differentiation of the ureter requires WNT signaling in the early undifferentiated UM
研究人员进一步通过不同时期离体培养结合IWP-2抑制，界定WNT信号对输尿管细胞分化最关键的时间窗。结果发现，E11.5或E12.5早期未分化阶段对WNT抑制最为敏感，培养终点平滑肌形成显著不足；而E14.5或E18.5阶段抑制WNT，对平滑肌投资影响较小。与此相对，单纯IWP-2处理并未显著重现Ctnnb1-cKO中的上皮严重分化障碍，提示上皮异常主要不是因“WNT不足”，而是因“上皮WNT异位激活”。这一步为后续筛选间充质WNT直接靶基因提供了关键实验依据。

Mesenchymal WNT signaling affects the SHH-FOXF1-BMP4 signaling axis
在E11.5与E12.5野生型输尿管中短期高剂量IWP-2抑制WNT后，转录组显示下调基因显著富集于WNT信号、平滑肌发育及Hedgehog相关过程。与既往SHH抑制数据集交叉比对发现，多个SHH依赖基因同时受WNT抑制影响，包括Ptch1、Hhip、Foxf1/Foxf2/Foxl1基因簇以及Bmp4。RT-qPCR验证了Axin2、Fzd10、Ptch1、Hhip、Foxf1、Bmp4等的下调。结合公共ChIP-Seq数据库分析，作者在Ptch1、Ptch2、Foxf1/Foxf2/Foxl1和Bmp4等基因邻近区域检测到CTNNB1与LEF/TCF共占位峰，提示这些基因很可能是经典型WNT信号的直接转录靶标。该结果将间充质WNT与SHH-FOXF1-BMP4模块直接联系起来。

WNT signaling differentially affects the components of the SHH-FOXF1-BMP4 signaling axis in the UM
随后，研究人员通过药理补救实验进一步解析WNT对该信号轴各组分的作用层级。E12.5输尿管短期IWP-2处理可消除Axin2表达并削弱Ptch1、Foxf1、Gata6与Id2；加入SHH激动剂purmorphamine或BMP4后，Axin2不能恢复，而Ptch1、Foxf1及BMP4下游标志得到部分改善。长程培养实验中，BMP4可部分恢复平滑肌标志表达，purmorphamine单独或联用BMP4则更有效促进SMC分化；相反，强制表达Foxf1本身不足以单独救援。说明WNT信号对SHH、FOXF1、BMP4各环节均提供正向输入，其作用并非仅经单一中介传递，而是对整个促肌性模块进行增强和区域化配置。

讨论部分总体指出，间充质WNT信号在输尿管早期发育中具有双重核心功能：其一，在间充质内直接或近直接增强SHH-FOXF1-BMP4信号轴，驱动Myocd及平滑肌分化程序，并帮助将平滑肌命运限制于间充质内层；其二，通过未知中介抑制上皮中的经典型WNT活性，使上皮得以解除对Trp63、Pparg、Foxa1等促分化转录因子的抑制，从而完成分层和成熟。研究同时指出，Ctnnb1-cKO上皮并未转变为肾集合管命运，而是停滞于肾管/早期输尿管芽样前体状态。作者还讨论了Dkk2等分泌性WNT调控因子可能参与间充质对上皮WNT的抑制，但该机制仍待进一步解析。

研究结论可译为：本研究加深了对协调早期输尿管细胞分化之信号网络的认识。间充质WNT信号不仅在间充质命运决定中发挥中心作用，而且通过增强SHH-FOXF1-BMP4信号轴并抑制上皮WNT信号，促进上皮分化。总体而言，该文的重要意义在于将间充质WNT信号从“平滑肌命运调控因子”提升为“输尿管上皮—间充质协同分化总协调器”，为理解先天性输尿管发育异常的分子基础提供了更完整的框架。