《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Feed restriction affects follicular development by regulating cell cycle progression in porcine mural granulosa cells
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背景哺乳动物的生殖结局受全身能量状态的影响，尤其是在高产母猪中。在哺乳期，高能量需求常导致严重的负能量平衡（NEB），进而损害后续的繁殖性能。哺乳期能量不足对断奶后卵泡发育的持续影响的分子过程尚不清楚。研究人员假设这种能量短缺会破坏壁颗粒细胞（GCs）的发育，
背景哺乳动物的生殖结局受全身能量状态的影响，尤其是在高产母猪中。在哺乳期，高能量需求常导致严重的负能量平衡（NEB），进而损害后续的繁殖性能。哺乳期能量不足对断奶后卵泡发育的持续影响的分子过程尚不清楚。研究人员假设这种能量短缺会破坏壁颗粒细胞（GCs）的发育，最终损害卵母细胞发育能力。研究人员旨在通过营养干预来阐明能量状态调控壁颗粒细胞（GC）发育的分子过程。结果在14天的饲喂限制期间，接受限制日粮（RES；3.25 kg/d）的母猪体重和背最长肌深度损失是全饲喂母猪（FF；日粮6.5 kg/d）的两倍。卵巢重量和最大健康卵泡的平均大小均显著降低。RNA-seq分析在RES颗粒细胞（GCs）中鉴定出2,282个差异表达基因，其中1,531个上调，751个下调。最富集的通路是细胞周期，通过CDK1免疫染色得到证实。RES颗粒细胞（GCs）中关键的正向细胞周期调控因子（如CCNA1/2、CCNB1-3、CCNE2）上调，而细胞周期抑制因子CDKN1A（P21）下调。与FF颗粒细胞（GCs）相比，在RES颗粒细胞（GCs）中，IGFBP家族的几个成员，尤其是IGFBP7，与大多数细胞周期相关基因（包括FOXO1、CDKN1A）及卵泡大小呈强相关，且仅在RES颗粒细胞（GCs）中观察到，而非FF母猪。增殖标志物（PCNA和MKI67）也上调，而分化标志物CYP19A1下调。结论数据表明，严重的哺乳期负能量平衡（NEB）对断奶后壁颗粒细胞（GCs）有持续影响，延迟其从增殖到终末分化的转变。研究人员提出一个潜在调控轴，其中胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs），特别是IGFBP7，可能通过AKT-FOXO1-CDKN1A-细胞周期调控轴连接能量代谢与卵泡发育。这些分子改变可能导致了在能量限制后观察到的卵母细胞能力受损。此外，研究结果将IGFBP7确定为连接代谢状态与卵泡发育的候选生物标志物。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
哺乳动物的生殖功能与机体能量状态密切相关，尤其在高繁殖力母猪中表现显著。现代高产母猪在哺乳期面临巨大的能量需求，常导致严重的负能量平衡（NEB），进而损害后续的繁殖性能，表现为断奶后发情率降低、产仔数减少，即“二胎综合征”。尽管已有研究证实哺乳期能量不足会抑制断奶后卵泡发育，但其中的分子机制尚不明确。特别是，能量短缺如何影响壁颗粒细胞（GCs）的发育，进而损害卵母细胞质量，是亟待解决的关键科学问题。该研究旨在通过营养干预模型，系统解析能量状态调控壁颗粒细胞（GC）发育的分子通路，为优化母猪哺乳期营养管理提供理论依据。该论文发表在《Journal of Animal Science and Biotechnology》。
**研究内容与结论**
研究人员选用初产母猪（TN70，大白猪与挪威长白猪杂交），在哺乳期最后两周（第10天至断奶）对部分母猪实施50%的饲喂限制（RES，3.25 kg/d），对照组自由采食（FF，6.5 kg/d），以模拟严重负能量平衡（NEB）。断奶后所有母猪均喂食3 kg/d直至断奶后48小时（卵泡中期），随后收集卵巢，分离最大健康卵泡的壁颗粒细胞（GCs），进行激光捕获显微切割（LCM）结合低起始量RNA测序，并辅以免疫组化验证。研究共纳入27头母猪（FF组13头，RES组14头），基于体重损失极端值筛选。
**主要技术方法**
1. **激光捕获显微切割（LCM）**：从冷冻卵巢切片中精确分离最大健康卵泡的壁颗粒细胞（GCs），确保细胞纯度。
2. **UMI-based RNA-seq**：使用唯一分子标识符（UMI）技术进行低起始量RNA测序，减少技术噪声，准确定量基因表达。
3. **加权基因共表达网络分析（WGCNA）**：构建基因共表达网络，识别与表型性状（卵泡大小、卵巢大小、体重损失等）显著相关的模块。
4. **基因集富集分析（GSEA）**：对差异表达基因进行功能注释，鉴定显著富集的通路（GO和KEGG）。
5. **免疫组化（IHC）**：验证关键蛋白CDK1和CDKN1A在壁颗粒细胞（GC）中的表达和定位。
**研究结果**
**1. 饲喂限制减少体重、肌肉质量和卵泡发育**
RES母猪体重损失和背最长肌深度损失显著高于FF母猪（P<0.0001），而背膘损失无显著差异。卵巢重量和最大健康卵泡直径均显著降低（P<0.01），表明能量限制抑制了卵泡生长。
**2. 标记基因纯度验证与FF和RES组间差异mRNA表达模式**
通过标记基因表达分析确认壁颗粒细胞（GC）纯度（颗粒细胞标志物高表达，卵泡膜细胞和免疫细胞标志物低表达）。主成分分析（PCA）显示两组部分分离，差异表达基因（DEG）分析共鉴定2,282个差异基因（RES vs FF），其中1,531个上调，751个下调。
**3. 整合功能富集与加权相关网络分析**
WGCNA鉴定出MEYellow模块与所有表型（卵泡大小、卵巢大小、体重损失等）显著相关，且该模块主要富集于细胞周期相关通路。GSEA进一步证实“细胞周期”通路在RES颗粒细胞（GC）中正向富集最显著。关键细胞周期正向调控因子（CCNB1-3、CCNA2、CCNE2、CDK1等）上调，而抑制因子CDKN1A下调。
**4. 关键细胞周期调控因子CDK1和CDKN1A的验证**
免疫组化显示，CDK1蛋白水平在RES颗粒细胞（GC）中显著升高，并与mRNA水平正相关。CDKN1A蛋白主要定位于细胞质，且细胞质CDKN1A水平在RES颗粒细胞（GC）中显著升高，与mRNA下调趋势一致（细胞质CDKN1A具有促增殖作用）。
**5. 调控CDKN1A的潜在上游通路和调控因子**
AKT是CDKN1A的负调控因子，FOXO1可结合CDKN1A启动子。RES颗粒细胞（GC）中FOXO1 mRNA显著下调，AKT1呈上调趋势。FOXO1与CDKN1A在RES组中正相关。IGFBP家族成员（IGFBP2、IGFBP4、IGFBP7）在RES颗粒细胞（GC）中显著下调，且IGFBP7与FOXO1、CDKN1A及关键细胞周期调控因子在RES组中呈强相关，提示IGFBP7可能作为上游传感器，通过AKT-FOXO1-CDKN1A轴调控细胞周期。
**6. 卵泡大小与IGFBPs、FOXO1、CDKN1A及细胞周期调控轴的相关性**
在RES组中，卵泡大小与IGFBP7、IGFBP4、FOXO1、CDKN1A呈正相关，与CDK1、CCNB1等负相关，而FF组无此关联。同时，增殖标志物PCNA和MKI67在RES颗粒细胞（GC）中上调，分化标志物CYP19A1下调，表明RES颗粒细胞（GC）处于更增殖、分化延迟的状态。
**7. 糖酵解和线粒体代谢在RES母猪中均上调以支持颗粒细胞（GC）生长**
RES颗粒细胞（GC）中糖酵解通路关键酶（PFKFB3、HK2、PKM、LDH）及氧化磷酸化（OXPHOS）相关基因广泛上调，表明能量限制后细胞通过增强代谢通路支持增殖需求。
**结论与讨论**
研究结果表明，哺乳期严重负能量平衡（NEB）对断奶后壁颗粒细胞（GC）有持续影响，延迟其从增殖到终末分化的转变。研究人员提出一个潜在调控轴：IGFBP家族成员（特别是IGFBP7）可能作为能量状态传感器，通过调控AKT-FOXO1-CDKN1A-细胞周期通路，促进颗粒细胞（GC）增殖，抑制其分化。这些分子改变可能解释了能量限制后观察到的卵母细胞能力下降。此外，IGFBP7被确定为连接代谢状态与卵泡发育的候选生物标志物，为未来生殖营养调控策略提供了新靶点。
