《Mycobacteria》：False detection of rifampicin resistance using Xpert MTB/RIF Ultra due to a P454L mutation on rpob in Mycobacterium tuberculosis: a case report
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在结核病（tuberculosis, TB）管理中，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）建议检测利福平（rifampicin, RIF）耐药性以制定适宜的抗生素方案。几乎所有（95%）利福平耐药结核分枝杆菌（Mycoba
在结核病（tuberculosis, TB）管理中，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）建议检测利福平（rifampicin, RIF）耐药性以制定适宜的抗生素方案。几乎所有（95%）利福平耐药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）均源于rpob基因利福平耐药决定区（rifampicin resistance-determining region, RRDR）内的染色体突变，该区域位于密码子426至452之间。Xpert? MTB/RIF Ultra（Cepheid）是一种用于检测RRDR内突变的快速基因型方法。研究人员报道了一例初始经Xpert? MTB/RIF Ultra（Cepheid）检测为利福平耐药的涂阳肺结核病例。研究人员利用Deeplex? Myc-TB（GenoScreen）进行的扩展基因型药物敏感性试验（drug susceptibility testing, DST）迅速揭示了rpob上存在孤立的P454L突变，该结果经全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）证实。此突变不包含在RRDR内，且被WHO归类为不确定（即无明确证据表明该突变与利福平耐药相关，3组）。未发现其他抗结核药物（异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和氟喹诺酮类）的耐药突变。研究人员在等待MGIT法表型DST结果（即19天）期间，初始给予患者利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和左氧氟沙星治疗，结果发现其对利福平、异烟肼和乙胺丁醇敏感。利福平的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）为0.125 mg/L（微量稀释法）。随后停用左氧氟沙星及乙胺丁醇。三药联合治疗持续略多于1个月，继以两药联合（利福平、异烟肼）治疗4个月。在6个月治疗结束时，肺结核被认为已治愈。治疗结束后3个月随访，患者健康状况良好且无呼吸道症状。研究人员在此首次报道了由于结核分枝杆菌rpob上的P454L突变导致Xpert MTB/RIF Ultra（Cepheid）假阳性检测利福平耐药的案例。该临床案例说明了通过临床医生与微生物学家的合作以及获取一系列快速分子生物学诊断工具，实现肺结核个性化有效管理的潜力。
该研究发表于《Mycobacteria》。在结核病管理领域，世界卫生组织推荐检测利福平耐药以指导抗结核方案制定。已知约95%的利福平耐药结核分枝杆菌由rpob基因的利福平耐药决定区染色体突变引起，该区域位于密码子426至452之间。Xpert MTB/RIF Ultra是检测RRDR内突变的常用快速基因型方法。然而，现有研究已报道过少数因RRDR外突变或非基因突变因素导致的Xpert Ultra假阳性案例，例如A451V突变及淋巴结穿刺样本基质效应等，但尚未有关于rpob基因P454L突变导致假阳性的报道。由于P454L位于RRDR之外，WHO将其归类为不确定意义突变（3组），其与表型耐药的关系不明确。若Xpert Ultra误判此类突变为耐药，将导致患者被错误归类为耐多药结核病并接受更复杂漫长的治疗及隔离措施，增加不必要的医疗负担与患者风险。因此，研究人员开展此项病例报告研究，旨在首次揭示P454L突变引发Xpert MTB/RIF Ultra假阳性耐药检测的临床实例，探讨分子诊断局限性与验证流程的重要性，为更新诊断算法及WHO突变目录提供依据。
研究人员针对一名2024年秋季就诊的28岁南美裔男性涂阳肺结核患者开展研究。主要关键技术方法包括：采集患者痰液样本进行抗酸染色涂片检查；使用Xpert MTB/RIF Ultra及MDR/MTB ELite MGB试剂盒进行初步分子耐药检测；应用基于下一代测序的Deeplex Myc-TB技术进行扩展基因型药物敏感性试验以筛查15种抗结核药相关基因突变；对分离菌株进行全基因组测序并使用SNP-IT工具及WHO突变目录进行变异注释与分析；采用MGIT系统及肉汤微量稀释法测定表型药物敏感性及最低抑菌浓度；全程结合临床多学科会诊进行个体化治疗决策与随访监测。
Background
研究人员指出结核病管理需检测利福平耐药，绝大多数耐药由rpob基因RRDR（密码子426至452）突变导致，Xpert MTB/RIF Ultra用于检测RRDR突变但存在假阳性可能，如既往报道的A451V突变及基质效应案例，本研究则聚焦首次报告的P454L突变致假阳性情况。
Case presentation
一名无相关病史的28岁南美裔男性因夜间发热、盗汗、咳嗽伴大量咯血就诊，童年有药物敏感结核接触史，CT示右上叶肺炎伴空洞。痰涂片抗酸杆菌阳性。Xpert MTB/RIF Ultra检测结核分枝杆菌复合群阳性（高载量）并报告利福平耐药（rpob 4探针熔解温度异常，Mut B为62.7℃），MDR/MTB ELite MGB亦报利福平耐药（rpob 2探针异常）但异烟肼敏感。Deeplex Myc-TB测序在rpob基因（覆盖26.8%）检出孤立P454L突变（基因组索引761,167，参考核苷酸C，替代核苷酸T），属WHO 3组不确定突变，且未检出其他一线及二线药耐药突变。全基因组测序确认rpob基因完全覆盖，存在固定C→T替换导致P454L，无其他耐药相关突变。表型DST（MGIT法，19天）证实对利福平（临界浓度1 mg/L）、异烟肼、乙胺丁醇敏感，微量稀释法测利福平MIC为0.125 mg/L（判为敏感）。初期治疗含利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、左氧氟沙星，表型确认敏感后停左氧氟沙星与乙胺丁醇，改为三药联合月余后继以利福平+异烟肼双药4个月，期间因血药浓度不足将利福平增至900 mg/日。治疗6个月末判愈，停药3个月后随访健康无症状。
Discussion and conclusions
研究人员讨论认为本案例证明临床与微生物学家协作及快速分子工具可实现肺结核个性化管理。初期加用左氧氟沙星的桥接策略基于P454L位于RRDR外且意义不明、无其他耐药突变、家族史及能快速获验证结果。文献中P454L曾伴随RRDR内其他突变（如D435Y、H445Y）出现于表型耐药株，但孤立存在时未见表型耐药报道，若累积更多孤立P454L且表型敏感并治疗成功的案例，可考虑将WHO目录重新分类为4或5组（不关联耐药）。Xpert Ultra假阳性会导致患者管理复杂化，本研究系首次报道P454L致假阳性，建议制造商优化探针设计（当前rpob 4探针覆盖446至455，可缩减至446至453）以防误判。结论是研究人员首次报告了结核分枝杆菌rpob基因P454L突变导致Xpert MTB/RIF Ultra假阳性检测利福平耐药的案例，该临床案例说明了通过临床医生与微生物学家的合作以及获取一系列快速分子生物学诊断工具，实现肺结核个性化有效管理的潜力。
