《Bioscience Nanotechnology》：Recent advances in isothermal amplification-integrated nanomaterial-based biosensing platforms for sensitive detection of cancer-related nucleic acids
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癌症相关核酸标志物（包括循环肿瘤DNA和非编码RNA）在生物体液中的丰度极低，尤其在疾病早期阶段，其检测仍是重大分析挑战。等温核酸扩增（INAA）已成为传统聚合酶链反应（PCR）方法的有力替代方案，可在恒定温度条件下实现目标序列的高效扩增，同时降低仪器复杂性。
癌症相关核酸标志物（包括循环肿瘤DNA和非编码RNA）在生物体液中的丰度极低，尤其在疾病早期阶段，其检测仍是重大分析挑战。等温核酸扩增（INAA）已成为传统聚合酶链反应（PCR）方法的有力替代方案，可在恒定温度条件下实现目标序列的高效扩增，同时降低仪器复杂性。与此同时，将纳米材料集成至生物传感平台可为信号转导、放大及探针固定提供多功能界面。本综述系统梳理了2020–2025年间结合INAA策略与纳米材料功能化设计的生物传感平台在癌症相关核酸检测中的最新进展。研究人员首先阐述了主要INAA方法的基本原理与机制多样性，涵盖酶辅助体系（环介导等温扩增[LAMP]、滚环扩增[RCA]、重组酶聚合酶扩增[RPA]、链置换扩增[SDA]、指数扩增反应[EXPAR]）及无酶体系（杂交链式反应[HCR]、催化发夹组装[CHA]），并明确了各类方法的优势与局限。随后，研究人员批判性讨论了上述方法在生物传感架构中的集成策略，重点阐明纳米材料如何通过优化表面工程、增强催化活性及改善信号生成来提升分析性能。进一步分析了融合CRISPR/Cas系统、侧向层析试纸、微流控技术、DNAzyme催化及智能手机辅助读数的新兴混合平台，展现了其在构建高灵敏、便携式及多重诊断系统方面的显著进展。最后，研究人员探讨了当前检测稳健性、标准化及临床转化面临的挑战，并对下一代即时护理（POC）癌症诊断技术的发展进行了展望。本综述为理解INAA基生物传感平台的设计原则与功能集成提供了统一框架，可为超灵敏核酸检测的未来创新提供指导。
引言
癌症是全球重大公共卫生挑战，2023年全球新发病例约1850万例，死亡人数超1000万，且发病率预计在未来数十年持续上升。尽管治疗手段不断进步，患者预后仍高度依赖诊断分期——晚期或转移性癌症的生存率急剧下降，而分子改变常早于临床症状数月甚至数年出现，因此早期精准检测成为改善临床结局的决定性因素。液体活检作为一种无创诊断策略，通过捕获肿瘤细胞释放至体液的核酸片段，为早期筛查提供了可能。其中，循环肿瘤DNA（ctDNA）可反映肿瘤特异性基因变异，长链非编码RNA（lncRNA）与微小RNA（miRNA）则表征转录及转录后调控变化，是最具临床价值的生物标志物。然而，这些标志物在生物基质中丰度极低，要求检测平台兼具高灵敏度、高特异性与操作简便性，以满足实际诊断需求。传统检测手段存在固有局限：组织活检虽为金标准，但侵入性强、成本高且难以覆盖肿瘤时空异质性；酶联免疫吸附试验（ELISA）等免疫分析法灵敏度不足，且在复杂基质中易产生交叉反应；PCR及其衍生技术虽通过指数扩增提升了核酸检测性能，但对精密热循环设备与中心实验室的依赖限制了其在资源有限场景下的应用。等温核酸扩增（INAA）无需热循环，在恒定温度下即可实现高效靶标扩增，显著降低仪器要求、成本与操作复杂度，为POC诊断提供了理想解决方案。目前已发展出LAMP、RCA、RPA、SDA、HCR、CHA等多种INAA技术，各具扩增效率与适用场景优势。将INAA集成至生物传感平台可实现信号转导、读出门类的灵活化与设备微型化，但如何高效将生化反应转化为可测量的输出信号仍是核心挑战。纳米材料凭借高比表面积、可调理化性质及多样信号转导机制，成为连接INAA反应与检测模块的桥梁，可显著提升低丰度标志物检测的灵敏度与稳定性。本综述系统梳理2020–2025年INAA基纳米材料生物传感平台的研究进展，首先解析主流INAA技术的原理与特征，继而探讨纳米材料在传感界面构建、信号生成与读出门类中的功能角色，最后总结当前挑战与未来方向，为相关领域研究提供理论参考。
等温扩增技术在生物传感平台开发中的集成
等温扩增方法的原理与分类
等温扩增（IA）指在37–65°C恒定温度下进行的核酸扩增技术，无需PCR所需的热循环步骤，从而简化仪器要求并拓宽操作条件。所有IA方法的共同生化约束是模板可及性——传统PCR通过95°C变性解链暴露单链模板，而IA需在无热变性的前提下克服双链核酸的热力学稳定性。根据作用机制差异，IA可分为两大类：酶辅助等温扩增与无酶等温扩增。酶辅助方法依赖特定蛋白质催化实现链分离与模板复制，根据链访问机制不同又可细分为：利用具有链置换活性的聚合酶同步合成新链并置换互补链的方法；利用重组酶、解旋酶等辅助蛋白主动解旋双链DNA以促进引物结合的方法；利用位点特异性切口内切酶引入单链缺口作为下游置换合成起始点的方法。此类方法通常可实现靶序列的指数或线性扩增，分析灵敏度高，但试剂稳定性易受基质干扰物影响。无酶等温扩增不依赖蛋白质催化剂，而是利用合成核酸结构的程序化热力学性质，通过触发序列诱导亚稳态发夹分子发生自发不可逆构象重排，经级联杂交事件实现检测信号的放大而非靶序列本身的复制。该方法无需冷链储运，但扩增效率与反应动力学通常低于酶辅助体系。
主要IA技术的概览与比较分析
IA技术可根据扩增机制与酶依赖性分为聚合酶驱动扩增系统、核酸酶辅助扩增系统与无酶核酸电路扩增系统。聚合酶依赖的等温扩增方法主要依赖链置换DNA聚合酶在恒定温度下连续合成核酸，代表性技术包括LAMP、RCA、RPA、EXPAR与SDA。指数扩增反应（EXPAR）通过链置换DNA聚合酶延伸与单链切口酶活性协同作用，在55–60°C下实现对短寡核苷酸序列的指数级扩增，反馈循环中新生触发序列可启动新一轮扩增，10?–10?倍扩增效率常在数分钟内完成。滚环扩增（RCA）以环状DNA为模板，在Φ29 DNA聚合酶的作用下连续绕环合成含重复序列的长单链DNA串联体，反应温度通常为室温至37°C，可通过设计模板序列引入功能域、报告序列或结合基序，实现单分子识别事件到强扩增信号的转化。重组酶聚合酶扩增（RPA）利用重组酶介导的引物靶向与链置换DNA聚合酶协同作用，在37–42°C下实现核酸扩增，重组酶蛋白形成核蛋白丝搜索同源序列并促进链入侵，无需热变性即可直接访问双链DNA靶标，对样本抑制剂耐受性强，适用于POC与现场检测。链置换扩增（SDA）通过链置换DNA聚合酶与位点特异性切口内切核酸酶的协调作用实现指数扩增，引物设计中引入切口酶识别位点，延伸过程中掺入修饰核苷酸形成半磷酸硫酯键，经酶切后引发链置换循环，反应温度约37°C，需注意引物与识别位点的设计以维持特异性。环介导等温扩增（LAMP）采用多对引物与自循环链置换合成机制，在60–65°C下通过形成茎环结构与自引物环实现连续扩增，Bst DNA聚合酶催化下30–60分钟即可积累大量DNA产物，多靶点识别赋予其极高特异性，但引物设计复杂度较高。
无酶扩增策略主要包括杂交链式反应（HCR）与催化发夹组装（CHA）。HCR由两种亚稳态发夹探针（H1与H2）组成，在引发链触发下通过趾端介导的链置换交替打开发夹，自组装形成含重复H1–H2单元的长双链DNA聚合物，无需酶参与且反应条件温和，信号产物分子量随靶标浓度升高而增加。CHA中两种互补发夹（H1与H2）处于动力学陷阱状态，触发链通过趾端介导的链置换打开H1并暴露序列与H2杂交，形成稳定双链后释放触发链进入下一轮循环，实现靶标循环利用与信号放大。两类无酶方法均无需蛋白催化剂，操作简便且稳定性高，但HCR动力学较慢，CHA的效率则高度依赖发夹设计与热力学优化。整体而言，酶辅助方法扩增速度快、灵敏度高，无酶方法则胜在操作简单、稳定性好且成本低，二者在分析中具有互补优势。需注意的是，“酶辅助/无酶”分类应针对单个扩增模块：HCR与CHA本身为无酶核酸电路模块，但当其与RCA、连接酶、聚合酶延伸、切口反应或CRISPR/Cas介导的信号转导集成时，整体检测流程属于混合酶辅助/无酶级联系统。此外，酶辅助方法的局限性可通过试剂稳定化或冻干工艺缓解，无酶系统的慢动力学与背景泄漏问题则需借助辅助信号增强策略解决，技术选择需综合考量应用场景、灵敏度需求、检测时长、储存形式、基质耐受性及便携读出门类的兼容性。
等温扩增技术在癌症生物标志物检测生物传感平台开发中的集成
癌症相关核酸标志物在生理体液中的极低丰度要求检测灵敏度达到飞摩尔（fM）至阿摩尔（aM）级别，传统生物传感平台难以满足需求。IA技术通过靶标回收或产物积累机制实现分子信号放大，将微弱识别事件转化为可检测信号，且无需热循环设备，可与电化学、光学、荧光、比色等多种检测模式兼容，适配表面传感器、微流控与纸基设备。2019–2026年的研究显示，CHA与RCA各占IA辅助癌症DNA生物传感研究的28%，HCR占23%，SDA（10%）、EXPAR（7%）占比较低，LAMP（2%）、RPA（1%）及其他方法（1%）报道较少。CHA与HCR的无酶特性提升了反应稳定性、降低了成本；RCA生成的长串联DNA链可提供高密度信号报告分子结合位点，便于传感器表面集成，三者因兼顾灵敏度与稳健性成为主流选择。
代表性研究中，基于HCR的电化学传感器通过靶标miRNA触发带二茂铁标签的发夹探针组装，在金电极表面形成长程双链DNA串联体，二茂铁富集产生的氧化还原电流较未扩增背景高20倍，检测限达3 fM，可区分单碱基错配并准确量化癌细胞系中的mRNA水平。RCA集成的比率电化学传感器通过切口内切酶辅助靶标回收与φ29 DNA聚合酶驱动的RCA，在金电极表面生成长单链DNA产物，结合亚甲基蓝信号放大与双信号比率差分脉冲伏安读出门类，实现p53基因的0.23 fM检测限，并在人血清样本中验证了可靠性。CHA集成的电化学传感器耦合肽核酸（PNA）-DNA异源三向结形成与靶标回收放大，利用CHA产物的稳定组装实现二茂铁高密度负载，对miRNA-21的检测限达0.15 fM，特异性与抗背景噪声能力优异。
新兴技术进一步拓展了IA生物传感的功能边界。CRISPR/Cas系统与IA的集成实现了可编程靶标识别与信号放大：Cas-Rainbow平台结合RCA、HCR与Cas12a，通过双重IA过程与CRISPR介导的信号转导，实现乳腺癌相关三种miRNA的单反应多重检测，灵敏度达fM级别；RCA-Cas13a-DNAzyme联用平台通过Cas13a反式切割触发RCA，生成的G-四链体在血红素存在下形成过氧化物酶模拟DNAzyme，催化显色底物氧化，实现miRNA-10b的可视化检测，灵敏度达fM级；超分支滚环扩增（HRCA）-Cas12a平台通过替换PAM要求为泡状结构，降低假阳性率，实现miRNA-10b与miRNA-21的双靶标成像；CRISPR Cas9切口酶介导的RCA（CRIRCA）平台可直接以染色体外DNA（ecDNA）为模板，实现单细胞水平的ecDNA定量。此外，CRISPR/Cas12a与CHA、EXPAR的集成也实现了多种癌症标志物的超高灵敏检测。
DNAzyme增强的IA生物传感通过催化信号输出提升转导效率：CHA触发的三价DNAzyme结合同位素Mg2?依赖性催化核心，可高效切割固定在金电极上的G-四链体底物，释放大量G-四链体与血红素结合形成电活性物质，实现let-7a的0.46 fM检测限；切口RCA（n-RCA）自组装多组分核酸酶（MNAzyme）耦合荧光适配体的无标记传感器，通过MNAzyme切割茎环抗Mango RNA底物释放荧光适配体，实现miRNA-21的aM级检测；发夹/DNA环三元复合物启动的RCA策略通过生成重复DNAzyme序列切割荧光分子信标，实现let-7a的aM级检测，并具备单碱基错配分辨能力。
其他技术方向包括荧光共振能量转移（FRET）与生物燃料电池（BFC）的集成：RCA-FRET生物传感器利用RCA产物提供的高密度探针支架，增强供体-受体荧光共振能量转移效率，实现miRNA-494的pM级检测与单碱基区分；时间分辨FRET（TR-FRET）结合RCA进一步通过镧系螯合物供体与染料标记受体的长寿命荧光信号抑制自体荧光，实现血浆miRNA-21的120±20 fM检测限；酶促BFC自供电生物传感器耦合RCA，通过RCA产物 scaffold 增强[Ru(NH?)?]3?/2?氧化还原介质的负载与电子传递，实现miRNA-155的fM级检测，为微创标志物监测提供了新思路。
等温扩增策略在POC应用与混合生物传感系统中的发展
侧向层析试纸（LFA）集成的IA系统通过级联扩增提升可视化检测灵敏度：超分支杂交链式反应（HRCA）-试纸条生物传感器通过唾液miRNA-31触发磁珠上的HCR-RCA级联反应，生成大量G-四链体结构，与血红素结合形成DNAzyme催化显色底物氧化，在试纸条检测线产生肉眼可见信号，检测限达3.21 fM，与qRT-PCR结果一致性良好，适用于口腔鳞状细胞癌的无创筛查。
微流控基IA生物传感平台通过自动化样本处理提升实用性：集成EXPAR的微流控芯片系统通过上游磁珠富集裂解细胞外囊泡，下游芯片内直接进行EXPAR扩增，无需传统RNA纯化步骤，可在1.5小时内完成8种外泌体miRNA的多重检测，配合物联网读出门类实现便携式分析，推动了液体活检的POC转化。不同IA技术与POC格式的兼容性存在差异：RPA与LAMP因恒温高效扩增适合LFA集成，RPA低温快速反应特性尤其适配便携设备，LAMP则需注意引物设计与非特异性控制；RCA生成的長ssDNA产物适合miRNA靶向的纸基与微流控平台，但需额外连接或环化步骤；HCR与CHA的无酶特性简化了试剂储存，但慢动力学常需辅助信号增强策略。
智能手机辅助IA生物传感平台通过移动成像实现定量检测：CHA耦合G-四链体/血红素DNAzyme的银镀基底生物传感器，通过CHA组装释放G-四链体形成催化活性DNAzyme，催化ABTS氧化产生比色信号，经智能手机RGB值提取实现BRCA-1基因的0.6 pM检测限；RCA耦合分裂纳米萤光素酶-DNA嵌合体的生物传感器，通过RCA产物支架组装失活萤光素酶片段恢复酶活性，利用智能手机直接捕获生物发光信号，实现肺癌相关循环miRNA的aM级检测，可准确区分患者与健康对照。此类平台显著提升了检测便携性与用户可及性。
纳米材料在IA基生物传感平台中的作用
纳米材料通过增强信号转导效率、提升表面负载能力与强化光学/电化学/催化响应，与IA技术协同构建了高灵敏、稳定、微型化的生物传感平台。
贵金属纳米材料（金、银及双金属）是应用最广泛的信号增强组件。金纳米颗粒（AuNPs）凭借优异导电性、高比表面积与易功能化特性，可作为探针固定支架：四面体DNA（TDNA）偶联AuNPs的电化学传感器结合SDA与CHA，实现miRNA的10 aM检测限；CHA诱导的AuNP网络构建的表面等离子体共振（SPR）/表面增强拉曼散射（SERS）双模式生物传感器，分别实现42.5 fM与2.91 fM的检测限；RCA产物与AuNPs的多价相互作用支撑了LFA试纸条的视觉信号生成，成功检测胃癌相关miRNA；AuNPs修饰的电极结合CHA与RCA构建的DNA walker电化学传感器，对miRNA-21的检测限达10.6 aM。除球形AuNPs外，金纳米结构（纳米棒、纳米花、纳米簇等）通过形貌依赖的光电性质进一步提升性能：金纳米succulent薄膜电极耦合CHA与葡萄糖氧化酶标记的AuNPs，实现miRNA-21的0.65 fM检测限；金纳米棒（AuNRs）作为多腿DNA walker的轨道，通过RCA产物驱动walker沿AuNR表面移动切割荧光发夹，实现miRNA-21的0.8 fM检测限；金纳米颗粒围绕金纳米棒形成的核卫星结构，通过同步激活SERS与荧光双信号，将miRNA-21的检测限分别降至0.165 fM与0.196 fM，并具备活细胞成像能力。
银基纳米材料（银纳米颗粒[AgNPs]与DNA稳定银纳米簇[AgNCs]）凭借强荧光特性与低成本优势，成为荧光IA生物传感的重要选择：CHA触发的DNA/AgNCs荧光恢复传感器实现miRNA-21的200 pM检测限；AgNPs@凝胶基质增强的EXRCA-HCR级联荧光传感器，通过金属增强荧光（MEF）效应将miRNA-21的检测限提升至21.47 fM，适配纸基平台实现快速可视化分析；AgNPs作为电化学信号标签，结合链置换聚合与CRISPR/Cas12a反式切割，实现let-7a的31 aM检测限，在临床血清样本中验证可靠。金银纳米材料的互补特性——金材料的多功能信号转导与银材料的优异荧光增强，共同支撑了复杂样本中高灵敏检测的需求。
半导体纳米材料与量子点（QDs）凭借可调电子特性与高效电荷转移能力，主导光电化学（PEC）与电化学发光（ECL）生物传感领域：ZnO纳米星作为共反应加速器，耦合HCR与鲁米诺功能化AuNPs，构建的ECL传感器实现miRNA-21的18.6 aM检测限；Pd@UiO-66金属有机框架耦合CHA，实现miRNA-21的0.713 fM检测限；CdSe QDs作为荧光供体，通过单量子点FRET策略结合多重引物生成RCA（MPG-RCA），实现KRAS G12D单核苷酸突变的5.4×10?2? M检测限，可分辨0.001%的突变频率；碳点（CDs）与InP/ZnS QDs构建的荧光纸基分析装置（PADs），通过RCA扩增与智能手机色度分析，实现胃癌相关miRNA-21与circRNA-HIAT1的fM级双靶标检测；(Co,S)共掺杂BiOBr纳米花耦合LAMP，构建的信号关闭型PEC传感器实现miRNA-221的0.24 fM检测限；聚集诱导发光纳米颗粒耦合SplintR连接与RPA，实现miR-499与H-FABP的双靶标LFA检测，31分钟内完成分析，临床样本验证AUC达0.964。此类材料虽性能卓越，但重金属QDs的生物相容性与环境安全性仍需关注，未来需开发环保型半导体纳米材料。
碳基与二维纳米材料通过高比表面积与独特理化性质增强IA信号转导：MXene纳米片支撑铂纳米线（PtNWs）形成的PtNWs/MXene纳米酶，耦合RCA与CRISPR/Cas14a，构建的外泌体miRNA-205电化学传感器实现aM级检测限，可准确区分鼻咽癌患者与健康对照；氧化石墨烯（GO）通过π-π堆积与荧光猝灭效应，构建的RCA荧光传感器实现唾液miRNA-21（3.85 fM）与miRNA-16（8.81 fM）的检测，与RT-qPCR结果一致；Ti?C?-Au-Ru纳米复合材料提供稳定的ECL参比信号，耦合趾端介导链置换扩增，构建的比率电化学/ECL传感器实现miRNA-18a的9 aM检测限，通过信号比值有效补偿电极表面差异，提升检测重现性。
金属有机框架（MOFs）与多孔纳米结构通过可调孔隙率与高表面积优化IA生物传感性能：Pd@UiO-66耦合CHA的电化学传感器实现miRNA-21的亚fM级检测；沸石咪唑酯框架（ZIFs）原位生长于纸通道的距离型微流控PAD，通过RCA产物增加溶液粘度调节表面疏水性，利用毛细管流动长度差异实现miR-221与miR-222的亚pM级检测，无需显色反应即可肉眼判读。MOFs的多孔结构还可促进质量传递与探针固定，为简化POC设备设计提供了新思路。
磁性纳米材料通过磁分离、靶标预富集与洗涤功能降低复杂基质干扰：羧基化磁性颗粒（MPs）作为固相载体，耦合锁核酸（LNA）捕获探针与RCA，构建的BRAF V600E突变电化学传感器实现55 pM检测限，可区分单碱基错配，与测序结果一致；Au@Fe?O?纳米颗粒作为磁基底与荧光猝灭剂，耦合脂质双层支持的3D DNA rolling walker，实现miRNA-16的aM级荧光检测；LAMP耦合DNA组装框架结构（DAFS）与Au@Fe?O?，构建的电化学传感器实现miRNA的48 aM检测限，50分钟内完成分析；旋转磁场耦合磁性纳米链的个人血糖仪（PGM）读出门类POC系统，通过LAMP扩增与蔗糖酶释放，实现BRAF V600E突变20拷贝/μL的检测限；Fe?O?@AuNPs作为捕获单元的SERS生物传感器，通过HCR信号放大与银染增强，实现miRNA-141的0.03 fM检测限；双3D DNA纳米机器耦合CHA与磁性电极，构建的无固定化电化学传感器实现miRNA的0.14 fM检测限，25分钟内完成反应，显著提升碰撞效率与扩增动力学。
纳米材料的选择需与IA机制及检测模式理性匹配：半导体材料多用于PEC/ECL与RCA联用体系，贵金属纳米材料适配多种IA技术的信号转导，碳基与二维材料擅长背景抑制与比率信号输出，MOFs与磁性材料则侧重样品净化与富集。最具临床价值的平台并非仅追求最低检测限，而是需平衡灵敏度、检测时长、基质耐受性、重现性、工作流程简化程度及在真实生物样本中的验证表现。
结论
等温核酸扩增与纳米材料生物传感的融合显著推进了癌症标志物检测领域的发展，为复杂生物基质中超低丰度核酸的检测提供了高效解决方案。INAA策略消除了热循环需求，纳米材料则赋予了信号转导、探针固定与催化增强的多功能特性，二者的互补集成构建了高灵敏、高选择性与强适应性的生物传感平台。酶辅助IA系统提供快速高效的靶标扩增，无酶系统则提升了操作稳定性与简便性，结合电化学、光学与比色等多种检测模式，检测限常可达fM至aM级别。CRISPR/Cas系统、微流控、LFA、DNAzyme催化与智能手机读出门类的引入，进一步推动了IA基生物传感向多重化、便携化与用户友好化方向发展。然而，酶辅助体系的试剂稳定性、无酶体系的慢动力学与背景泄漏、纳米材料合成的批次差异性、重金属材料的生物相容性问题以及多模块集成的复杂性，仍是制约临床转化的关键瓶颈。未来研究需聚焦于开发高稳定性扩增系统、防泄漏核酸电路、标准化纳米材料合成协议，推进样本进-结果出的一体化微流控设备研发，结合机器学习辅助信号分析与环保型纳米材料，最终通过大样本临床验证与规模化制造策略，推动INAA基生物传感器从概念验证走向常规临床应用，为下一代癌症诊断与精准医疗提供变革性工具。
