盐酸依米丁（Emetine dihydrochloride）抑制基孔肯雅病毒nsP2解旋酶并在细胞和小鼠中显示出强效抗病毒活性

《Journal of Biomedical Science》：Emetine dihydrochloride inhibits Chikungunya virus nsP2 helicase and shows robust antiviral activity in cells and mice

　　

背景：基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一种蚊媒甲病毒（alphavirus），频繁引起基孔肯雅热全球流行，其特征是严重关节痛和衰弱性关节炎。由于缺乏特异性抗病毒治疗，这些暴发构成了重大公共卫生挑战，特别是在热带地区。因此，迫切需要开发新型抗病毒药物。药物重定位（Drug repurposing）是识别靶向CHIKV复制的潜在抗病毒药物的一种有吸引力的策略。方法：研究人员使用高内涵细胞成像筛选Spectrum Collection已批准药物库，以识别潜在的CHIKV复制抑制剂。在C57BL/6小鼠CHIKV疾病模型中评估这些抑制剂的效力，监测病毒血症（viremia）和关节肿胀等临床症状。研究人员在ERMS细胞中研究了抑制剂对病毒摄取、复制、RNA合成和蛋白质产生的影响。使用计算机分子对接（In silico molecular docking）研究抑制剂与CHIKV蛋白质的结合。使用微量热泳（microscale thermophoresis）和等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry）在体外验证结合。测量在盐酸依米丁（emetine dihydrochloride，ED）存在下的CHIKV解旋酶（helicase）、蛋白酶（protease）和ATP酶（ATPase）活性以确定其作用机制。结果：在高内涵筛选鉴定的四种CHIKV抑制剂中，ED在小鼠模型中有效抑制CHIKV复制，产生显著较低的病毒血症水平。值得注意的是，接受ED治疗的CHIKV感染小鼠未显示关节肿胀的临床症状。在ERMS细胞中，ED通过抑制病毒RNA合成阻断CHIKV摄取和早期复制，进而阻止病毒蛋白产生。计算建模预测ED结合在CHIKV nsP2解旋酶结构域的RNA结合位点周围。体外验证证实ED与CHIKV nsP2呈剂量依赖性结合。ED以浓度依赖性方式特异性抑制解旋酶解旋（helicase unwinding），而不影响ATP酶或蛋白酶活性。结论：本研究证明ED通过结合CHIKV nsP2并抑制其解旋酶活性，在培养细胞和感染小鼠模型中抑制CHIKV复制。虽然这是ED抗病毒作用的一个有前景的病毒靶向机制，但其他宿主导向的机制值得进一步研究。

论文发表在《Journal of Biomedical Science》。研究背景方面，基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（alphavirus），主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播，感染人类后引起急性发热、皮疹、肌痛及严重关节痛，部分患者的关节症状可持续数月甚至数年，造成长期残疾与社会经济负担。目前尚无针对CHIKV的特异性抗病毒疗法获批，现有治疗以对症支持为主，且尽管已有疫苗获批，药物研发仍迫在眉睫。药物重定位（Drug repurposing）策略因可利用已知药物的安全性数据与药代动力学特征，成为加速抗病毒开发的重要途径。本研究基于此背景，旨在从已上市药物库中筛选并验证具有抗CHIKV活性的候选分子，阐明其作用机制。

研究人员通过开展高通量筛选、细胞水平药效评价、小鼠感染模型治疗实验、分子对接与动力学模拟、生物物理结合验证及酶学功能检测等一系列工作，发现盐酸依米丁（emetine dihydrochloride，ED）作为已获批的抗阿米巴药物，在纳摩尔浓度下显著抑制CHIKV复制，在C57BL/6小鼠模型中降低病毒血症并完全阻断关节肿胀症状，其机制为特异性结合CHIKV非结构蛋白nsP2的解旋酶（helicase）结构域并抑制其RNA解旋活性，而不影响ATP酶（ATPase）或蛋白酶（protease）功能。该研究为ED重定位用于CHIKV治疗提供了实验依据，并揭示nsP2解旋酶作为广谱甲病毒抗病毒靶点的潜力。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：基于高内涵成像（high-content cell imaging）的Spectrum Collection药物库高通量筛选；C57BL/6小鼠皮下感染CHIKV模型评估体内病毒血症与爪水肿（paw edema）；ERMS细胞中病毒结合、摄取及时间加药（time-of-addition）实验；计算机分子对接（in silico molecular docking）与100 ns分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟；微量热泳（Microscale Thermophoresis，MST）与等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）验证蛋白-配体结合；CHIKV nsP2全长及结构域（解旋酶域、蛋白酶域）的原核表达与纯化；基于荧光标记的RNA解旋酶（helicase）活性检测、比色法ATP酶（ATPase）活性测定及FRET蛋白酶（protease）活性 assay；链特异性定量实时PCR（strand-specific qRT-PCR）分析正负链RNA；位点定向诱变（Site-directed mutagenesis）构建nsP2突变体；以及宿主蛋白合成的嘌呤霉素标记（puromycin labelling）检测。

研究结果部分保留小标题并简述如下：

Screening of the Spectrum Collection for anti-CHIKV compounds：研究人员通过对2560种化合物的一级、二级及三级筛选，在BHK-21、ERMS和Vero细胞中鉴定出四种在0.5 μM下仍保持大于80%抑制率的化合物（celastrol、niclosamide、gambogic acid、ED），其中ED的选择性指数（Selectivity Index，SI = CC₅₀/IC₅₀）高达967，IC₅₀为10 nM。

Anti-CHIKV efficacy of the selected compounds in mice：在C57BL/6小鼠模型中，ED（10 mg/kg/d腹腔注射）完全抑制CHIKV诱导的爪水肿，而niclosamide、gambogic acid无效，celastrol仅延迟水肿。剂量递减实验显示皮下给药6 mg/kg/d有效，3 mg/kg/d部分有效，1 mg/kg/d无效；且该剂量低于人用抗阿米巴剂量（1 mg/kg/d换算为小鼠12 mg/kg/d），提示安全窗口存在。

Antiviral potential of ED against CHIKV in mice：延迟给药实验表明，即使在感染后48 h皮下给予ED（6 mg/kg/d），仍能显著抑制爪水肿、体重下降及病毒血症，说明ED在治疗窗口内具有疗效。

CHIKV replication kinetics in ERMS cells in the presence of ED：在ERMS细胞中，ED从3 h post-infection（pi）起即显著降低正负链CHIKV RNA及病毒滴度，0.01 μM即有效果，且呈剂量依赖性，表明其作用于早期复制阶段。

ED affects early events during CHIKV replication：时间加药实验显示ED在3 h pi加入时抑制最强，随加药时间延后（6 h、12 h pi）抑制减弱，提示作用于进入后早期事件。

ED inhibits viral protein synthesis in CHIKV-infected cells：Western blot显示0.1 μM ED即降低nsP2蛋白水平；嘌呤霉素标记显示10 μM ED抑制宿主蛋白合成，但0.1 μM时宿主翻译几乎不受影响，说明病毒蛋白减少源于RNA合成抑制而非广义翻译阻断。

ED binds to the CHIKV nsP2 protein in silico：分子对接显示ED与nsP2解旋酶域和蛋白酶域均有结合倾向，其中解旋酶域对接得分更负（?5.399 kcal/mol），结合自由能（ΔG_bind）为?61.77 kcal/mol，预测结合位点为Site-1（RNA结合区周围）。

ED binds to the CHIKV nsP2 helicase domain：ITC测得ED与全长nsP2的K_d为1.2 μM，与解旋酶域K_d为2.56 μM，不与蛋白酶域结合；MST验证全长K_d为1.5 μM，解旋酶域K_d为3.06 μM，证实特异性结合解旋酶域。

ED inhibits the nsP2 helicase activity：解旋酶实验显示ED浓度依赖性抑制nsP2解旋双链RNA（dsRNA），0.1 μM即显著抑制，但不抑制蛋白酶（FRET assay）及ATP酶（colorimetric assay）活性，对照Withaferin A（WFA）不抑制解旋酶。

Characterization of the ED binding site on the nsP2 helicase：MD模拟显示ED在Site-1稳定结合100 ns；关键残基包括Lys210、Lys211、Asp235、Phe286、Phe287、Phe164、Ala381、Thr261、Tyr161；构建Phe164Ala突变体后MST测K_d升至29.40 μM，证实Phe164参与结合。

ED binds around the RNA-binding site of the nsP2 helicase：MST竞争实验显示ED存在时nsP2与RNA结合K_d从297 nM降至1.12 μM，Cy5-RNA与nsP2结合K_d从256 nM升至29 μM，表明ED结合于或邻近RNA结合位点，干扰RNA-蛋白相互作用。

ED inhibits CHIKV uptake：0.1 μM ED不影响病毒结合（binding），但约30%抑制摄取（uptake）；20 μM ED直接孵育病毒无病毒灭活（virucidal）效应，提示摄取抑制可能为次要机制。

ED inhibits the replication of different alphaviruses：ED在0.001–0.1 μM间显著抑制辛德毕斯病毒（Sindbis virus，SINV）与罗斯河病毒（Ross River virus，RRV）的RNA与滴度，因其nsP2解旋酶关键残基保守，显示广谱甲病毒（alphavirus）抑制潜力。

讨论部分总结：研究人员讨论指出，ED作为已知药物具有药代与安全性基础，其在细胞IC₅₀为10 nM，SI达967，体内皮下6 mg/kg/d（人等效剂量约0.49 mg/kg/d）低于传统人用剂量，毒性风险较低。ED主要通过结合nsP2解旋酶域、抑制RNA解旋而非ATP水解来阻断负链合成，从而抑制整个基因组复制；此机制区别于依米丁经典的核糖体延伸抑制（40S亚基）作用，因为在0.1 μM抗病毒有效浓度下宿主翻译未受显著影响。此外ED可能轻微影响病毒摄取及具有抗炎（NF-κB抑制）潜能，但非主要机制。IC₅₀与K_d差异源于细胞累积与功能放大效应。nsP2解旋酶在甲病毒中高度保守，故ED具广谱前景。研究局限性包括所用小鼠模型仅反映急性期、未评估慢性后遗症，且体内直接靶标验证尚缺耐药筛选。未来需PK/PD与安全评估。

结论部分翻译：本研究表明ED通过在培养细胞和感染小鼠模型中结合CHIKV nsP2并抑制其解旋酶活性来抑制CHIKV复制。虽然这是ED抗病毒作用的一个有前景的病毒靶向机制，但其他宿主导向的机制值得进一步研究。