VSIG4+巨噬细胞过继转移通过阻断CCL2-CCR2炎症放大环路减轻小鼠及人器官oid模型中对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤

《Journal of Translational Medicine》：Adoptive transfer of VSIG4+ macrophages interrupts the CCL2-CCR2 inflammatory amplification loop to mitigate acetaminophen-induced acute liver injury in murine and human organoid models

　　

背景：急性肝损伤（ALI）可快速进展为危及生命的急性肝衰竭，肝移植仍是唯一确定性治疗手段，但供体严重短缺。基于巨噬细胞的疗法在ALI中显示出前景，但面临亚群不精确及缺乏人源化验证的挑战。VSIG4通常被认为是库普弗细胞（Kupffer cells, KCs）的标志物，然而其也在单核细胞衍生巨噬细胞（MoMFs）中表达，其在ALI中的作用尚不明确。方法：研究人员通过整合人与小鼠肝组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据及临床ALI组织样本，阐明了肝内VSIG4+巨噬细胞（VSIG4+ Mφ）的动态变化。研究人员开发了一种可逆免疫磁纳米颗粒系统用于非破坏性分离存活的VSIG4+ Mφ。通过在乙酰氨基酚（APAP）诱导的ALI小鼠模型及新建立的血管化人肝器官oid ALI与单核细胞趋化模型中，进行组织与分子水平分析，评估了VSIG4+ Mφ的治疗功效与潜在机制。结果：scRNA-seq揭示了此前未被充分认识的表达VSIG4的MoMFs亚群在ALI后增加，而驻留的VSIG4+ Kupffer细胞数量显著减少。临床ALI组织样本也证实了ALI患者肝中存在CCR2+VSIG4+细胞。在APAP诱导的ALI动物模型中，过继转移分离的VSIG4+ MoMFs显著降低了血清丙氨酸氨基转移酶、肝坏死与凋亡，同时增加了抗炎细胞因子。相比之下，过继转移未分选的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）未能改善肝损伤，反而加剧了某些促炎反应，包括TNF-α升高与CD206表达降低。机制上，VSIG4+ MoMFs通过抑制NF-κB依赖的CCL2转录阻止炎症放大，从而破坏CCL2-CCR2趋化轴并减少促炎性CCR2+单核细胞与巨噬细胞招募。研究人员进一步开发了血管化人肝器官oids及APAP诱导的肝细胞损伤与单核细胞趋化模型，发现该趋化阻断机制在人肝器官oid ALI模型中完全重现。讨论：本研究确定VSIG4+ MoFMs作为ALI中治疗可行的亚群，相较于未分选BMDM具有明显优越性。通过阻断CCL2-CCR2炎症放大环路，这些细胞在小鼠与人源化模型中均减轻了肝损伤。这些一致发现为推进VSIG4+ Mφ为基础的免疫疗法进入临床实践提供了强有力的临床前证据。

研究背景方面，急性肝损伤（ALI）是肝病谱中的关键环节，临床结局两极分化，要么通过肝脏内在再生能力恢复，要么快速进展为危及生命的急性肝衰竭（ALF）。若不进行肝移植，ALF患者生存率仅为百分之二十七至四十，尽管急诊肝移植将一年生存率提升至约百分之八十，但受限于全球供体短缺，近百分之十六的等待名单患者死亡，这迫切需要在ALI进展至ALF前进行干预的有效疗法。对于终末期肝病，细胞治疗成为有前景的策略，肝细胞衍生的肝祖细胞样细胞已成功移植于肝硬化，胆道上皮细胞的好制造规范兼容成分限定培养系统也已建立，提供安全可扩展的细胞来源。靶向肝脏免疫微环境以修复肝脏避免移植受到显著关注，巨噬细胞极化与重编程已在骨关节炎等其他炎症性疾病中被治疗性利用。巨噬细胞在肝损伤中起双重作用，早期加剧炎症，而具有修复功能的替代激活巨噬细胞（AAMs）通过吞噬细胞碎片、分泌抗炎介质及促进组织再生来协调消退。近期临床前研究表明，即使在N-乙酰半胱氨酸治疗窗口后给药，冷冻保存的人AAMs也能有效减少APAP诱导ALI中的坏死、调节炎症并增强再生，确认了现货型巨噬细胞疗法的可行性，近期综述强调AAMs疗法是ALI中新兴且必要的选择，APAP诱导损伤可能是最初的临床应用，但当前AAMs方法面临两个根本挑战，一是体外细胞因子诱导AAMs仅粗略指示细胞功能，体内外环境差异导致表型变异，难以精确定义与可重复生产，二是AAMs疗法临床前评估主要依赖小鼠模型，可能无法完全复制人肝复杂免疫微环境，缺乏人源化验证构成转化关键障碍，因趋化因子信号与免疫细胞功能的种属差异可能干扰临床疗效预测。在定义的巨噬细胞亚群中，表达V-set and immunoglobulin domain containing 4（VSIG4）的巨噬细胞因在维持肝脏免疫耐受与抑制过度炎症中的独特作用备受关注，VSIG4是主要在巨噬细胞上表达的跨膜补体受体，作为关键免疫检查点分子在多种疾病中具有强效抗炎与组织保护特性。不同于广泛定义的M2巨噬细胞，VSIG4⁺巨噬细胞（VSIG4⁺ Mφ）代表自然发生的内源性免疫调节亚群，具有明确分子身份，提供更精确且潜在更安全的替代疗法。尽管VSIG4被广泛认为是驻留库普弗细胞（KCs）的经典标志物，但对ALI肝组织scRNA-seq分析及临床ALI肝组织染色均表明，炎症肝脏中一部分单核细胞衍生巨噬细胞（MoMFs）也上调VSIG4表达。研究人员假设精确分离VSIG4⁺ MoMFs亚群而非非特异性体外极化，能更有效重现ALI治疗所需的内在免疫调节功能，但目前尚无研究探索基于VSIG4⁺ Mφ的细胞疗法，ALI患者能否受益尚不清楚。VSIG4⁺ Mφ代表具有独特分子特征的自然发生内源性免疫调节亚群，提供更精确潜在更安全的治疗选项，研究人员假设输注该特定亚群可通过恢复肝脏免疫稳态有效缓解ALI，为此采用非破坏性免疫磁分离策略获取高活力VSIG4⁺ Mφ，在APAP诱导ALI小鼠模型及能重现肝细胞损伤与单核细胞趋化关键特征的血管化人肝器官oid系统中评估疗效，通过提供治疗性破坏CCL2-CCR2趋化轴跨物种可行有效的证据，为推进亚群特异性巨噬细胞免疫治疗走向ALI及其他炎症驱动肝病的临床评估奠定临床前基础。该研究论文发表在《Journal of Translational Medicine》。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括，整合公共与内部人及小鼠肝组织单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集与临床ALI组织样本（来自同济医院肝胆外科中心健康个体与ALI患者），开发含Endonuclease V（Endo V）切割位点的可逆免疫磁纳米颗粒（MNP@Oligo-VSIG4）系统非破坏性分离VSIG4⁺ Mφ，建立乙酰氨基酚（APAP）诱导的C57BL/6小鼠ALI模型（分为对照、ALI、治疗组尾静脉注射1×10⁶ VSIG4⁺ Mφ）进行评估，建立血管化人肝器官oid及APAP诱导肝细胞损伤与单核细胞（THP-1）趋化共培养模型，采用流式细胞术、免疫荧光、定量实时PCR（qPCR）、免疫印迹、RNA测序（RNA-seq）及加权基因共表达网络分析（WGCNA）等技术从组织分子水平分析细胞动态、治疗功效与NF-κB-CCL2机制。

研究结果部分保留小标题并说明如下。VSIG4⁺ kupffer cells are depleted during ALI, coinciding with pro-inflammatory microenvironment establishment，研究人员通过分析人与小鼠肝scRNA-seq数据及临床样本，发现ALI患者与APAP小鼠模型中驻留VSIG4⁺ Kupffer细胞显著减少，MoMFs（含VSIG4⁺ MoMFs即CCR2⁺VSIG4⁺）扩增，肝组织炎症因子（Tnf、Ccl2、Cxcl2等）上调，证实ALI进展伴随驻留巨噬细胞耗竭与过度活化炎症微环境建立。Development and validation of a reversible immunomagnetic platform for non-destructive isolation of viable VSIG4⁺ Mφ，研究人员构建MNP@Oligo-VSIG4纳米颗粒，通过Endo V切割寡核苷酸链接实现细胞非破坏性释放，捕获效率超百分之八十，释放效率超百分之九十五，分离后细胞活力高于百分之九十五，且VSIG4⁺ BMDM在LPS刺激下促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）显著低于未分选BMDM，具稳定抗炎表型。VSIG4⁺ Mφ ameliorate liver injury in APAP-induced ALI，研究人员在APAP小鼠模型尾静脉输注VSIG4⁺ MoMFs（1×10⁶），显著降低血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肝坏死与凋亡，增加肝内VSIG4⁺与CCR2⁺细胞但减少骨髓动员的CCR2⁺细胞，而未分选BMDM无改善甚至加剧促炎反应（TNF-α升高、CD206降低）。VSIG4⁺ Mφ suppress hepatic inflammation by inhibiting CCL2-mediated immune cells recruitment，研究人员通过RNA-seq与WGCNA分析发现VSIG4⁺ Mφ治疗逆转二十九个差异表达基因（DEGs），下调Ccl2表达，抑制NF-κB p65磷酸化，减少CCR2⁺单核巨噬招募，降低肝内促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）并升高抗炎因子（IL-10、TGF-β1）与CD206，阻断CCL2-CCR2炎症放大环路。Generation of human liver organoids that recapitulate the multicellular hepatic microenvironment，研究人员从健康人肝组织建立血管化肝器官oid，培养七至十天形成三维结构，保留HNF4α⁺肝细胞、CD31⁺内皮细胞、α-SMA⁺星状细胞与CD68⁺巨噬细胞，APAP处理导致LDH释放增加、Bcl2降低与Bax升高，成功建立ALI与单核细胞趋化模型。VSIG4⁺ Mφ mitigate APAP-induced injury in human liver organoids via NF-κB-CCL2 suppression，研究人员在肝器官oid ALI共培养模型中加入VSIG4⁺ Mφ，增加器官oid内VSIG4⁺细胞，降低LDH、恢复Bcl2/Bax平衡、减少凋亡，下调促炎因子与CCL2-CCR2轴组分，抑制p65磷酸化与CCL2表达，在人源系统中重现NF-κB-CCL2抑制的保守机制。

讨论部分总结，ALI快速进展至ALF仍是肝病学重大挑战，移植外治疗有限，巨噬细胞疗法有望拦截但该转化受亚群不精确与人源化验证不足阻碍，本研究通过整合scRNA-seq、可逆免疫磁分离与跨物种建模，确立VSIG4⁺ MoMFs为ALI治疗可行细胞亚群，定义NF-κB-CCL2轴抑制为保守机制。ALI进展以VSIG4⁺ KCs耗竭与大量VSIG4阴性炎症细胞浸润为特征，伴随过度活化炎症微环境，VSIG4作为补体受体与免疫检查点抑制T细胞反应、诱导调节性巨噬细胞极化、维持肝脏免疫耐受，过继转移后IL-10升高可能强化适应性免疫调节但本研究未直接评估适应性免疫参数。非破坏性MNP@Oligo-VSIG4平台十五分钟捕获释放优于流式分选，适用于GMP兼容细胞制造及其他免疫细胞亚群。机制上VSIG4⁺ Mφ抑制NF-κB p65磷酸化下调CCL2、减少CCR2⁺招募，VSIG4招募SHP-1去磷酸化TLR信号复合物（TRAF6、IRAK1）抑制NF-κB，该保护非短暂吞噬清除而是中断放大环路产生持续调节，相较于体外极化M2a的表型可塑性，VSIG4⁺ Mφ是自然发生表观固定亚群，体内稳定性需谱系追踪验证，未来需与M2直接比较。人肝器官oid保留血管窦结构使THP-1浸润实质区，小鼠与器官oid一致证据强化转化依据，但THP-1为转化细胞系，需用原代人巨噬细胞验证。局限包括复杂临床样本分离优化、过继转移细胞体内分布互作表征、疗效限于急性期需长期追踪。结论部分翻译为，本研究确立VSIG4⁺ Mφ作为ALI中精确定义、治疗有效的巨噬细胞亚群。与未分选BMDM（无法保护甚至加剧促炎特征）相比，VSIG4⁺ Mφ通过抑制NF-κB驱动的CCL2表达减轻肝损伤，从而中断CCL2-CCR2炎症放大环路并减少继发性单核巨噬招募。小鼠模型与人肝器官oid的一致发现为推进VSIG4⁺ Mφ疗法走向ALI及潜在其他炎症性肝病临床评估提供了强有力的临床前依据。