《Journal of Applied Genetics》：Impaired strigolactone biosynthesis and signalling are associated with promoter-associated CHH hypermethylation in Arabidopsis thaliana
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独脚金内酯（Strigolactone）是调节植物多种发育过程与胁迫响应的植物激素，但其潜在表观遗传调控作用仍知之甚少。此前多物种独脚金内酯突变体的转录组分析揭示了广泛的转录重编程，提示高阶调控机制失稳而非离散基因网络改变。研究人员在此探究独脚金内酯生物合成或
独脚金内酯（Strigolactone）是调节植物多种发育过程与胁迫响应的植物激素，但其潜在表观遗传调控作用仍知之甚少。此前多物种独脚金内酯突变体的转录组分析揭示了广泛的转录重编程，提示高阶调控机制失稳而非离散基因网络改变。研究人员在此探究独脚金内酯生物合成或感知受损是否与DNA甲基化模式改变相关。研究人员对拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型、独脚金内酯生物合成突变体max3及感知突变体d14的7日龄幼苗进行全基因组亚硫酸氢盐测序（Whole-genome bisulfite sequencing）。比较分析鉴定了CG、CHG和CHH序列背景下的差异甲基化区域（Differentially methylated regions）。CG甲基化改变无方向偏倚，非CG背景下两突变体均显著富集高甲基化区域，其中CHH背景效应最强。CHH高甲基化优先富集于启动子相关区域，主要重叠非编码与假基因位点，且在max3与d14间大量重叠，表明两突变体存在共有表观遗传响应。基因体相关区域呈相似但较弱模式。结果表明独脚金内酯通路受损持续关联选择性CHH高甲基化而非全局甲基化改变。由于植物中CHH甲基化通常关联RNA定向DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation, RdDM），所观察模式与改变的RdDM相关调控一致，但RdDM机制的直接参与尚待确立。本研究为探索独脚金内酯如何可能关联植物表观遗传调控提供了基因组框架。
该研究发表于《Journal of Applied Genetics》。目前关于独脚金内酯（Strigolactone）作为植物激素在发育与环境响应中的功能已有较多认识，但其参与表观遗传调控的证据仍有限且具情境特异性。既往转录组研究显示独脚金内酯突变体存在广泛转录重编程，提示可能涉及高阶调控机制失稳，而非单一基因网络改变；同时已有研究分别报道独脚金内酯信号抑制因子SMXL7与组蛋白去甲基化酶JMJ30互作调控H3K27me3与染色质可及性，以及外源独脚金内酯在盐胁迫下促进番茄DNA去甲基化并激活磷酸肌醇通路，表明独脚金内酯可能同时介入组蛋白与DNA层面的表观调控，但缺乏在非零胁迫条件下、基因组尺度的DNA甲基化变化证据，且生物合成与感知突变是否引发共有表观遗传响应尚不明确，因此研究人员开展本研究以明确独脚金内酯通路受损是否伴随全基因组DNA甲基化改变及其特征与分布。
研究人员以拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚-0（Col-0）野生型、独脚金内酯生物合成突变体max3（more axillary growth3）与感知突变体d14（dwarf14）为材料，设置4个生物学重复，对7日龄幼苗进行全基因组亚硫酸氢盐测序（Whole-genome bisulfite sequencing, WGBS），采用bisulfite-aware比对工具Bismark与DSS（Dispersion Shrinkage for Sequencing data）框架鉴定并筛选CG、CHG、CHH背景下的差异甲基化区域（Differentially methylated regions, DMRs），并按TAIR10注释将DMR定位于启动子相关区域（转录起始位点上游2 kb）与基因体相关区域（外显子、内含子与转录终止位点），以分析甲基化变化的上下文偏好与突变体间重叠情况。
研究结果如下。
Results
研究人员对野生型Col-0、max3与d14的7日龄幼苗进行高质量WGBS，亚硫酸氢盐转化效率超99.6%，比对率67–73%，平均覆盖深度15–23倍，96%以上胞嘧啶覆盖≥5倍。在max3与d14相对于野生型中，CG差异甲基化区域（DMRs）呈现高甲基化与低甲基化平衡，无方向偏移；非CG背景下CHG偏向高甲基化，CHH背景中该偏向最显著，高甲基化区域占优势，显示独脚金内酯通路受损持续关联CHH高甲基化。CHH高甲基化尤其富集于启动子相关区域：d14与max3分别有284和254个启动子相关CHH高DMR注释位点，其中146个为两基因型共有；启动子相关CHH低DMR较少（分别为72和63个，共有16个）。基因体相关区域（外显子/内含子/转录终止位点TES）呈相似但较弱的共有高甲基化富集。共有启动子相关CHH高DMR主要关联假基因与非编码RNA位点而非蛋白编码基因，如在AT2G06822（假基因）上游位点在两突变体中均显示CHH甲基化增加。结果表明CHH高甲基化选择性发生于启动子相关非编码与假基因区域，且在生物合成与感知突变体中共有，提示独脚金内酯功能受损导致共同的下游表观遗传后果。
Discussion
研究人员指出，独脚金内酯通路受损关联选择性且可重复的CHH高甲基化，尤其位于启动子相关区域，而非全局DNA甲基化改变；该效应在生物合成与感知突变体中方向一致，提示功能受损有共同表观遗传后果。植物中CHH甲基化主要由RNA定向DNA甲基化（RdDM）建立维持，响应发育与环境信号，因此所见CHH高甲基化富集与RdDM相关调控改变一致，尤其因其主要关联非编码与假基因位点，但具体分子组分尚未确定。本研究补充了独脚金内酯信号经SMXL7调控染色质架构（组蛋白层面）与外源独脚金内酯在非生物胁迫下诱导DNA去甲基化（特定胁迫条件）的证据，而在非胁迫条件下显示组成型独脚金内酯通路功能关联非编码与假基因区域CHH甲基化。目前已知独脚金内酯与RdDM的功能互作限于水稻（Oryza sativa）中RdDM靶向OsD14受体基因下游MITE（miniature inverted-repeat transposable element）元件，其CHH甲基化激活OsD14转录，RdDM受损致OsD14表达下降并反馈上调OsDWARF10（OsD10）致高分枝表型。本研究跨遗传背景揭示独脚金内酯通路受损与非编码及假基因区域CHH高甲基化的稳定关联，为机制解析提供基因组框架；局限在于仅分析单一发育阶段且未对个体CHH-DMR进行功能验证，但聚焦早期幼苗可减少发育混杂并检测基因型依赖表观改变。未来应探究独脚金内酯通路扰动是否影响小RNA种群、RNA聚合酶IV/V活性或染色质可及性，并在多发育阶段与环境情境中整合DNA甲基化谱、转录组与染色质水平分析。综上，结果为研究独脚金内酯信号与RdDM相关表观遗传调控的潜在关系建立了框架。
研究结论部分翻译如下：
结果表明独脚金内酯通路受损持续关联选择性CHH高甲基化而非全局甲基化改变。由于植物中CHH甲基化通常关联RNA定向DNA甲基化（RdDM），所观察模式与改变的RdDM相关调控一致，但RdDM机制的直接参与尚待确立。本研究为探索独脚金内酯如何可能关联植物表观遗传调控提供了基因组框架。
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