基于UPLC-MS化学谱分析与体外分离的药用植物欧阿米根来源内生真菌破坏链格孢（Alternaria destruens）生物活性次级代谢产物及其计算机模拟（in silico）研究

《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：UPLC-MS chemical profiling and isolation of bioactive secondary metabolites from Ammi visnaga-derived endophyte Alternaria destruens assessed by in silico studies

　　

摘要背景
微生物内生菌（endophytes）已成为生物活性次级代谢产物的潜在来源，并为克服药用植物过度消耗所带来的挑战提供了优良资源。Ammi visnaga 是一种广为公认具有药用价值的埃及药用植物。A. visnaga 的根通常被视为废弃产物；本研究旨在探索与 A. visnaga 根相关的真菌内生菌。

方法
采用聚合酶链式反应（PCR）对真菌分离株进行鉴定；在固体大米培养基上进行大规模发酵，随后以乙酸乙酯提取。真菌提取物经减压液相色谱（VLC）和高效液相色谱（HPLC）进行色谱纯化。分离化合物采用高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）和核磁共振（NMR）技术进行鉴定。采用超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-Q-Tof）对真菌提取物进行化学谱分析。采用纸片扩散法和最低抑菌浓度（MIC）实验评价其抗微生物活性。采用 AutoDock Vina 针对10种参与 DNA 复制、抗生素耐药性及毒力过程的细菌蛋白开展计算机模拟（in silico）评估。采用 Biovia Discovery Studio 并结合吸收、分布、代谢、排泄与毒性（ADMET）流程对化合物的药代动力学性质进行评价。

结果
从破坏链格孢（Alternaria destruens）NGB-AvF1 中分离并鉴定出4个化合物，包括1个先前未报道的苝醌环氧化物（1）以及3个已知聚酮类化合物（2–3，4）。采用 UPLC-Q-Tof 负离子模式对提取物进行代谢谱分析，初步鉴定出18个属于不同化学类别的次级代谢产物，其中聚酮类、苝醌类和异香豆素类占比较高。抗微生物活性评价显示，化合物2和3对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表现出强而具有选择性的抗菌活性，抑菌圈分别为28 mm 和30 mm。计算机模拟（in silico）评估显示，化合物2和3与多个关键酶具有有利的结合亲和力。化合物2与 DNA 连接酶、β-内酰胺酶（β-lactamase）和凝集因子A（Clumping factor A）表现出最强结合；化合物3则对 ClfA、DNA 连接酶和 β-内酰胺酶显示出较高亲和力。两种化合物还与分选酶A（Sortase A）、青霉素结合蛋白2a（PBP2a）和 BlaR1 呈现中等程度相互作用。这些结果提示化合物2和3具有多靶点抗菌活性。

结论
A. destruens 提取物显示出广泛的化学多样性，并表现出显著的抗微生物活性；计算机模拟（in silico）研究揭示了这些抗微生物化合物潜在的细菌作用靶点。化合物2–3表现出选择性且强效的抗菌活性，进一步支持其作为后续药物开发先导化合物的潜力。

该文发表于《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》，围绕药用植物内生真菌作为天然抗菌活性物质来源这一主题展开。研究背景在于，传统药用植物虽是天然产物的重要来源，但长期采收会带来资源消耗、濒危物种保护压力以及目标活性成分产率偏低等问题。相比之下，微生物内生菌（endophytes）能够在宿主植物组织内部稳定存在，不仅可产生结构多样的次级代谢产物，而且在某些情况下还能共享与宿主植物相近的生物合成途径，因此被视为缓解药用植物过度利用问题的重要替代资源。Ammi visnaga L. 是地中海地区尤其是埃及常见的重要药用植物，广泛用于泌尿系统疾病、肾绞痛、肾结石、白癜风、银屑病、哮喘和心绞痛等传统治疗，并且是 furanochromone 类代表成分 khellin 和 visnagin 的重要来源。与此同时，耐药菌株持续出现，使新型抗菌先导化合物的发现成为天然产物研究的重要方向。研究人员基于前期内生真菌提取物的抗菌筛选，发现来源于 A. visnaga 根部的内生真菌破坏链格孢（Alternaria destruens）NGB-AvF1 乙酸乙酯提取物具有较好的抗菌活性，因此选取该菌株开展化学与生物活性研究。文中还指出，A. visnaga 根通常被视作废弃部分，故从其根部挖掘内生真菌资源具有明显的新颖性和资源再利用意义。

在研究设计上，研究人员首先对来自 A. visnaga 根内组织的新鲜内生真菌进行分离，并通过 ITS 区 PCR 扩增及序列比对完成菌株鉴定，确认目标菌株为 Alternaria destruens，ITS 序列已提交 GenBank，登录号为 LC874654。随后对该菌株进行固体大米培养基的大规模发酵，使用乙酸乙酯提取其代谢产物，并对粗提物脱脂后采用减压液相色谱（VLC）分级，再通过半制备高效液相色谱（HPLC）纯化得到单体化合物。结构鉴定主要依赖高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）、高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）与核磁共振（NMR）数据。与此同时，研究人员还利用高分辨超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（HR-UPLC-ESI-Q-Tof MS）对提取物进行代谢谱分析，以实现已知成分的快速去重复鉴定（dereplication）并把握整体化学组成。生物活性方面，通过琼脂扩散法与最低抑菌浓度（MIC）评价粗提物和单体化合物对细菌与真菌的抑制作用。在机制探索层面，采用 AutoDock Vina 对活性最突出的化合物与10种细菌关键蛋白进行分子对接，靶点涉及 DNA 复制、细胞壁相关耐药机制及毒力因子；同时借助 Biovia Discovery Studio 进行吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）性质预测。整体而言，该研究将天然产物化学分离、代谢组学谱分析、体外抗菌评价以及计算机辅助药物发现策略相结合，形成了较完整的天然产物活性挖掘流程。

主要技术方法可概括为：其一，从埃及开罗大学药学院药用与芳香植物站采集的 A. visnaga 根内组织中分离内生真菌，并基于 ITS 区 PCR 测序进行分子鉴定；其二，对目标菌株进行固体发酵、乙酸乙酯提取、VLC 分级与半制备 HPLC 纯化，并结合 HRESIMS 与 NMR 鉴定化合物结构；其三，采用 HR-UPLC-ESI-Q-Tof MS 进行提取物代谢谱去重复分析；其四，通过琼脂扩散法和 MIC 测定抗菌活性；其五，利用 AutoDock Vina 与 Discovery Studio 开展分子对接和 ADMET 预测。

在结果部分，论文保留了较清晰的小标题结构，各部分共同支撑了该菌株的化学潜力和抗菌应用价值。

3.1 HR-UPLC-ESI-Q-Tof metabolic profiling of A. destruens extract
该部分通过负离子模式 HR-UPLC-ESI-Q-Tof-MS 对乙酸乙酯提取物进行化学谱分析，初步去重复鉴定出18个次级代谢产物，显示该真菌具有较高化学多样性。鉴定出的代谢物主要归属于聚酮类（polyketides）、苝醌类（perylene quinones）、异香豆素类（isocoumarins）、色原酮类（chromones）、四酰胺酸类（tetramic acids）、二肽、苯丙烷类、联苯醚衍生物及苯甲酸衍生物等类别。这一结果说明 A. destruens 并非仅产生少数优势成分，而是具备丰富且多类型的次级代谢能力。

3.1.1 Polyketides
在聚酮类成分中，研究人员初步鉴定出 alternariol、alternariol monomethyl ether、altenuisol、Pyranoviolin A 和 Penicyclone B 等。前3者与 Alternaria 属真菌的已知代谢特征高度一致，提示该菌株具有典型链格孢属化学特征；后两者则反映出其代谢谱中还存在跨属分布的天然产物类型。

3.1.2 Perylene quinones
在苝醌类成分中，初步鉴定出 alteroxin I、4,9-dihydroxy-3a,12c-dihydroperylene-3,10-dione、Alteroxin V 和 Stemphyltoxin IV。该类化合物通常具有五环氧化骨架，是 Alternaria 属中较受关注的一类真菌色素和真菌毒素相关代谢物。该部分结果提示该菌株能够生物合成多种苝醌骨架次级代谢物，也为后续分离到新苝醌化合物提供了化学依据。

3.1.3 Isocoumarins and chromones
该部分鉴定出3个异香豆素类代谢物及1个色原酮类化合物，包括 7-hydroxy-3-(2-hydroxy-propyl)-5-methyl-isochromen-1-one、Biatriosporin M、8-hydroxy-6-methoxy-3-methylisocoumarin 和 altechromone A。结果说明该内生真菌代谢途径中异香豆素/色原酮相关骨架占据一定比例，并与宿主植物 A. visnaga 富含苯并吡喃类化合物这一化学特征形成一定呼应。

3.1.4 Miscellaneous compounds
该部分还鉴定出 tenuazonic acid、diricinol D、4-hydroxycinnamic acid、alternarienonic acid 和 cyclo[leu-pro] 等杂类成分。其意义在于进一步扩展了该真菌代谢物组成图谱，并为粗提物表现出较广谱抗菌活性提供了可能的化学基础。

3.2 Isolation and identification of compounds
研究人员共分离得到4个单体化合物。化合物1为深红色针晶，基于 HR-ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、APT 及 HMBC 相关谱学数据，解析为一个对称二聚体苝醌环氧化物，命名为 3,10-dihydroxy-4,9-dioxo-5,6,7,8-diepoxy,4,5,6,6a,6b,7,8,9-octahydro-perylene。作者指出该化合物此前未见报道，为新化合物。化合物2–4分别鉴定为 alternariol、alternariol monomethyl ether 和 4-hydroxymellin。该结果表明，A. destruens NGB-AvF1 不仅能够产生 Alternaria 属常见标志性聚酮代谢物，还可产生新的苝醌类结构，为天然产物发现提供了新分子实体。

3.3 Evaluation of the antimicrobial activities of the total extract and the isolated compounds 1–4
抗菌评价结果显示，A. destruens NGB-AvF1 的脱脂粗提物对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和白色念珠菌（Candida albicans）均表现出抑制活性，其 MIC 分别为 18.75、9.38 和 4.75 μg/mL，说明粗提物具有较广谱的抗微生物潜力。进一步对分离得到的4个化合物进行筛选后发现，化合物2和3对 S. aureus 和 C. albicans 表现出显著活性，其中对 S. aureus 的抑菌作用尤为突出；MIC 结果显示，化合物2对 S. aureus 的 MIC 为 0.1 mg/mL，化合物3为 0.03 mg/mL。该部分结果说明，alternariol 及其单甲醚衍生物是该菌株抗菌活性的关键贡献成分之一，而粗提物活性谱较单体更广，提示提取物中可能存在多成分协同或其他未分离活性物质共同发挥作用。

3.4 Virtual screening assessments in silico
该部分通过分子对接与 ADMET 预测，从机制和成药性两个维度对活性化合物进行补充评价。

3.4.1 Molecular docking assessments
针对抗菌活性最突出的化合物2和3，研究人员选取10个细菌相关靶蛋白开展分子对接，包括二氢叶酸还原酶、β-内酰胺酶、拓扑异构酶IV、凝集因子A（ClfA）、分选酶A（SrtA）、DNA gyrase、DNA ligase、青霉素结合蛋白2a（PBP2a）、甲硫氨酸氨肽酶（MetAP）及 BlaR1。结果显示，两种化合物对多种蛋白均表现出良好结合倾向，多数对接分数低于 ?6.0 kcal/mol。化合物2对 DNA ligase、β-lactamase 和 ClfA 的结合最强；化合物3则对 ClfA、DNA ligase 和 β-lactamase 表现出较高亲和力。两者对 PBP2a、SrtA 和 BlaR1 亦呈中等偏强结合，而对 topoisomerase IV 的结合相对较弱。该结果支持化合物2和3可能通过干扰 DNA 复制修复、细胞壁相关耐药机制以及毒力黏附因子发挥多靶点抗菌作用，并且其部分对接表现与参考药物相当甚至更优。

3.4.2 ADMET assessments
ADMET 预测显示，A. destruens 分离的4个化合物均具有较好的肠道吸收能力，但水溶性较低；除化合物3显示中等血脑屏障（BBB）穿透外，其余化合物 BBB 穿透较低。所有化合物均表现出可接受的血浆蛋白结合特征，多数不抑制 CYP2D6，但均提示存在一定肝毒性风险。该结果说明这些天然产物在体内行为上具有一定开发潜力，但成药性优化仍是后续研究的重要方向。

讨论部分主要围绕化学组成、抗菌活性及计算结果三方面展开。首先，代谢谱分析证实 A. destruens 能够产生与 Alternaria 属已知报道高度一致的化学标志物，如 alternariol、alternariol monomethyl ether、tenuazonic acid 和 altertoxin I，表明本研究的化学鉴定结果具有较强属级一致性。新化合物1在结构上与 Stemphyltoxin IV 相近，但缺少 6a 位羟基，这一发现也与提取物代谢谱中检测到相关苝醌成分相吻合。其次，抗菌结果与既往有关 Alternaria 属代谢物抗菌潜力的文献相一致：粗提物具备较广谱活性，而化合物2和3则主要表现为对革兰阳性菌，特别是 S. aureus 的选择性强效抑制，提示粗提物中的总体活性可能来源于多类成分共同贡献，而非仅由已分离化合物解释。再次，分子对接结果与体外抗菌活性趋势相互支持，表明 alternariol（2）和 alternariol monomethyl ether（3）可能同时作用于 DNA ligase、β-lactamase、ClfA、PBP2a 和 BlaR1 等多个关键蛋白，从而实现多靶点抑菌。文中同时强调，计算机模拟和体外实验虽为活性探索提供了重要依据，但仍需进一步体内验证，尤其天然产物常受限于分离量不足，因此未来可结合化学合成、基因簇挖掘及异源表达等策略推进后续研究。

研究结论部分可译为：
从 A. visnaga 根部分离的内生真菌乙酸乙酯提取物抗菌筛选结果显示，A. destruens NGB-AvF1 具有最显著的抗菌活性，因此被选作化学研究对象。研究共分离得到4个化合物，其中包括1个新的苝醌环氧化物（化合物1）和3个已知聚酮类化合物（化合物2–4）。其中，alternariol（化合物2）和 alternariol monomethyl ether（化合物3）对 S. aureus 表现出强且具有选择性的抗菌活性，进一步支持其作为后续药物开发先导化合物的潜力。对于新化合物1，作者建议未来进一步考察其抗生物被膜活性，或在耐药菌株模型中重新评估其抗菌潜能，同时结合细胞毒性评价。分子对接进一步巩固了化合物2–3的抗菌潜力，显示其可与多个参与 DNA 复制、抗生素耐药性及毒力的细菌靶点良好结合。这些发现提示化合物2和3可能通过多靶点抑制机制发挥作用，并有望成为针对多重耐药病原体的新型抗菌先导骨架。对 A. destruens 乙酸乙酯提取物的 HR-Q-Tof 代谢组学分析初步鉴定出18个属于不同化学类别的次级代谢产物，其中以聚酮类、苝醌类和异香豆素类为主。该研究强调了对 A. visnaga 等尚未充分开发来源进行内生菌挖掘的重要性，同时展示了常见真菌内生菌 Alternaria sp. 的显著化学多样性。