富马酸单甲酯调节小胶质细胞中的铁代谢和线粒体功能，对多发性硬化进展的启示

《Cellular and Molecular Neurobiology》：Monomethyl Fumarate Modulates Iron Metabolism and Mitochondrial Function in Microglia with Implications for Multiple Sclerosis Progression

　　

富马酸酯已被证明在复发-缓解型多发性硬化（relapsing-remitting multiple sclerosis）中具有神经保护作用的有效药物。在这项研究中，研究人员比较了富马酸酯对原代小鼠小胶质细胞（primary murine microglia）体外的影响，与二甲基亚砜（DMSO）载体对照。富马酸单甲酯（Monomethyl fumarate, MMF）以剂量依赖性方式增加MTT还原，而富马酸二甲酯（dimethyl fumarate, DMF）表现出双相反应，低浓度增强MTT还原，高浓度诱导毒性。值得注意的是，对细胞数量和细胞死亡的补充分析未显示MMF处理组和对照组之间的差异，表明增加的MTT还原反映了细胞代谢活性增强而非活力增加。与此解释一致，在Seahorse XF细胞线粒体压力测试（Seahorse XF Cell Mito Stress Test）中，MMF处理的细胞表现出更高的基础耗氧率、最大耗氧率、备用呼吸能力和ATP产生。蛋白质组学分析未显示线粒体呼吸链蛋白上调，而是提示线粒体稳态的定性转变，包括线粒体自噬相关蛋白表达增加。MMF处理的Nrf2缺陷小胶质细胞显示MTT还原增加减弱，表明Nrf2参与介导MMF诱导的代谢效应。此外，MMF调节小胶质细胞铁代谢，减少非转铁蛋白结合铁（non-transferrin-bound iron）的摄取，并改变铁转运蛋白的基因表达，促进向摄取毒性较小的转铁蛋白结合铁（transferrin-bound iron）的转变。MMF减轻了铁诱导的毒性，并与铁死亡抑制蛋白（ferroptosis suppressor protein）上调相关，表明对铁过载的保护性反应。总之，这些发现表明MMF增强小胶质细胞代谢活性和线粒体功能，同时减少铁介导的毒性，从而有助于其神经保护作用。

多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种中枢神经系统（central nervous system, CNS）自身免疫性炎症疾病，导致脱髓鞘和神经退行性变，致使患者出现进行性残疾。近年来，复发-缓解型MS的免疫调节治疗取得显著进展，但针对进展期MS的治疗手段仍然有限，因为现有药物未能完全靶向进展期的病理机制。根据当前理解，进展期MS的特征是血脑屏障后方的慢性炎症，涉及T细胞、B细胞、活化胶质细胞和脑膜炎症。其中，活化的小胶质细胞（microglia）作为CNS的驻留免疫细胞，产生大量活性氧（reactive oxygen species, ROS），导致线粒体损伤和神经退行性变。最近的MRI研究显示，铁环病灶（iron rim lesions）与MS的神经退行性变密切相关，而神经病理学检查发现，铁负载的小胶质细胞是构成这些病灶的核心成分。在CNS中，铁主要储存于少突胶质细胞，疾病过程中这些细胞破坏释放出二价铁，后者可通过Fenton反应催化羟基自由基的非酶促生成，对神经元产生直接毒性。因此，减少铁介导的神经毒性成为寻找进展期MS新疗法的方向。富马酸酯（fumaric acid esters）如富马酸二甲酯（dimethyl fumarate, DMF）自2013年美国FDA批准以来，已用于复发-缓解型MS的治疗，具有免疫调节、抗氧化和神经保护作用。DMF及同类药物仅作为前药，其活性代谢产物为富马酸单甲酯（monomethyl fumarate, MMF）。然而，DMF可自由扩散进入细胞，引起谷胱甘肽耗竭并增加氧化应激，而MMF则主要通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）通路和羟基羧酸受体2（hydroxycarboxylic acid receptor 2, HCAR2）发挥效应。目前，MMF对小胶质细胞铁代谢和线粒体功能的具体影响尚不完全清楚，本研究旨在阐明这些机制，为进展期MS治疗提供理论基础。该论文发表在《Cellular and Molecular Neurobiology》。

研究人员开展研究时采用了以下主要关键的技术方法：原代小鼠小胶质细胞培养（来自新生C57BL/6野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠，动物来源为德国鲁尔大学波鸿医学部动物设施）；MTT还原实验评估细胞代谢活性；活细胞成像结合Hoechst 33342和碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色检测细胞死亡；Annexin V流式细胞术检测早期凋亡；Seahorse XF细胞线粒体压力测试（Seahorse XF Cell Mito Stress Test）测量耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）及相关参数；蛋白质组学分析（使用数据非依赖性采集模式DIA的Orbitrap质谱，样本来源：MMF或DMSO处理的原代小鼠小胶质细胞，每组9个生物学重复）；qPCR检测铁代谢相关基因表达；比色法Ferrozine检测细胞内铁含量；H2DCFDA流式细胞术检测ROS产生。

研究结果部分如下：

**MMF Increases Microglial Metabolic Activity in a Nrf2-Dependent Way**
通过MTT实验发现，MMF以剂量依赖性方式增加原代小鼠小胶质细胞的MTT还原，而DMF呈现双相反应：低浓度（25 μM）增强MTT还原，高浓度（50 μM）则降低MTT还原并诱导毒性。活细胞成像和PI染色显示，DMF增加细胞死亡，而MMF对细胞总数和死亡比例无显著影响，Annexin V染色也未发现早期凋亡差异，表明MMF增强的MTT还原反映的是代谢活性增加而非细胞活力或数量变化。在Nrf2^?/?小胶质细胞中，MMF对MTT还原的增强效应明显减弱，提示Nrf2通路介导了MMF的代谢效应。

**MMF Improves Mitochondrial Respiration**
Seahorse Mito Stress测试显示，MMF处理的小胶质细胞基础耗氧率、最大耗氧率、备用呼吸能力和ATP产量均呈增加趋势，而质子漏仅轻度增加，偶联效率不变。这些描述性结果表明MMF增强了线粒体呼吸功能，但需结合蛋白质组学进一步确认机制。

**Iron is Toxic to Microglia Through Reactive Oxygen Species**
铁（Fe²⁺）处理导致小胶质细胞MTT还原呈剂量依赖性下降，并伴随细胞死亡增加和ROS水平升高（H2DCFDA检测）。用MMF预处理24小时后再暴露于铁，可部分逆转铁诱导的MTT还原下降和细胞死亡，表明MMF对铁过载具有保护作用。

**MMF Reduces Microglial Iron Uptake and Alters Iron-metabolism**
Ferrozine检测显示，MMF预处理使细胞内铁摄取减少约20%。qPCR分析显示，MMF处理后铁输出蛋白ferroportin（Slc40a1）和转铁蛋白（Trf）表达升高，而铁输入蛋白DMT1（Slc11a2）和促炎因子TNF（Tnf）表达降低，提示MMF促进了向毒性较低的转铁蛋白结合铁摄取的转变。

**Proteomic Analysis**
蛋白质组学分析共定量4,838个蛋白组，主成分分析显示MMF处理组与对照组形成明显分离。差异表达分析鉴定出985个差异蛋白（校正p值<0.05）。功能富集表明，MMF处理组中高丰度蛋白主要与氧化应激反应、抗氧化功能、Nrf2信号通路相关，并包含多个铁死亡调节蛋白。值得注意的是，线粒体呼吸链复合体I-V的蛋白在对照组中丰度更高，而MMF组中高丰度蛋白多为线粒体自噬相关蛋白（如reticulophagy regulator 1、BAG家族分子伴侣调节因子3、sequestosome-1等），提示MMF可能通过增强线粒体自噬和蛋白质周转来改善线粒体质量，而非增加线粒体数量。此外，铁代谢相关蛋白如转铁蛋白受体及其上游调节因子铁响应元件结合蛋白2、铁输出蛋白natural resistance-associated macrophage protein 1在MMF组中丰度升高，铁死亡抑制蛋白也上调，与qPCR结果一致。

在讨论部分，研究人员总结指出，MMF通过Nrf2依赖途径增强小胶质细胞代谢活性，并改善线粒体呼吸功能，但蛋白质组学数据不支持线粒体生物合成增加，而是提示线粒体自噬增强和蛋白质周转加速，从而维持功能性线粒体群体。MMF还直接调节小胶质细胞铁代谢，减少非转铁蛋白结合铁摄取，促进转铁蛋白结合铁摄取，并上调铁死亡抑制蛋白，从而减轻铁介导的毒性。这些发现揭示了MMF的多重神经保护作用机制，为进展期MS的治疗提供了新思路。研究结论部分翻译如下：通过靶向铁介导的毒性和增强线粒体呼吸，MMF展现出多方面的有益效应。然而，还需要进一步的研究，包括在人类MS患者中的临床试验，以确认MMF作为进展期MS的潜在治疗药物。尽管如此，本研究的结果为开发针对这一具有挑战性和致残性疾病的新治疗策略提供了有价值的见解。