《Journal of Plant Diseases and Protection》：Fusarium isolates representing six species complexes from symptomatic scale-leaved conifers (Cupressaceae)
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柏树（Cupressaceae）在欧洲城市景观中常见种植，但频繁受真菌病害影响。在本研究中，研究人员调查了匈牙利不同地点与北美香柏（Thuja occidentalis L.）和扁柏属（Chamaecyparis）物种相关的病原真菌。研究人员从褐变、坏死组织中
柏树（Cupressaceae）在欧洲城市景观中常见种植，但频繁受真菌病害影响。在本研究中，研究人员调查了匈牙利不同地点与北美香柏（Thuja occidentalis L.）和扁柏属（Chamaecyparis）物种相关的病原真菌。研究人员从褐变、坏死组织中获得通过核核糖体内部转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序初步鉴定的镰刀菌（Fusarium）分离物。为达到种级分辨率，研究人员制备了单孢菌株，并利用部分翻译延伸因子1-α（translation elongation factor 1-α, TEF）、RNA聚合酶II最大亚基（RNA polymerase II largest subunit, RPB1）及第二最大亚基（RPB2-1和RPB2-2）进行了多基因系统发育分析。研究人员鉴定出代表六个种复合体的七种镰刀菌（Fusarium）物种：Clavus镰刀菌（Fusarium clavus，分离频率最高）、轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）、接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、禾谷镰刀菌（Fusarium culmorum）、Inflexum镰刀菌（Fusarium inflexum）、Negundinis镰刀菌（Fusarium negundinis）以及Celtidicola镰刀菌（Fusarium celtidicola）。据研究人员所知，本研究首次报道了这些镰刀菌（Fusarium）分类单元来自北美香柏（Thuja occidentalis）和扁柏属（Chamaecyparis sp.）树木。研究人员的发现扩展了若干镰刀菌（Fusarium）分类单元当前的宿主范围知识，并有助于更全面地理解与观赏针叶树相关的镰刀菌（Fusarium）物种多样性。
本研究发表于《Journal of Plant Diseases and Protection》。柏科（Cupressaceae）树木在欧洲温带气候区的公共与私人城市绿地中广泛作为观赏树种种植，但其常受到多种真菌病原引起的溃疡与枯萎等症状威胁，如Seiridium cardinale、Didymascella thujina及Kabatina thujae等。镰刀菌（Fusarium）属物种作为引起木本植物溃疡病的重要病原备受关注，例如引起松树脂溃疡病的Fusarium circinatum，且部分种类与树皮甲虫存在携播关联。此前Németh等人（submitted）在研究柏科树木溃疡样症状及入侵害虫时，通过nrDNA ITS序列初步鉴定出多个Fusarium属分离物，但缺乏种级水平的精确界定。鉴于Fusarium属内种复合体（species complexes）的高度多样性及其在宿主范围、生活型（从内生菌、腐生菌到病原菌）上的复杂性，开展分子系统发育层面的物种界定对于评估其潜在生态与病害风险至关重要。因此，研究人员旨在通过分子系统发育工具将取自匈牙利多地北美香柏（Thuja occidentalis）与扁柏属（Chamaecyparis sp.）病样中的Fusarium分离物鉴定至种级，明确其分类地位与组成多样性，并探讨其对观赏针叶树的致病潜力与宿主扩展意义。
为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：样本来源于匈牙利布达佩斯、Nagykovácsi及Hajógyári岛等多地采集的具黄褐化枝叶、树皮肿胀、开裂及树脂渗出等症状的Chamaecyparis sp.与Thuja occidentalis不同品种（如‘Malonyana’、‘Smaragd’）组织，共设4个样本组；通过无菌条件下木材切片分离真菌并于马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar, PDA）上培养，经稀释铺板技术获得19株单孢（monoconidial）菌株；利用Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit提取基因组DNA，选用EF1/EF2、5f2/7cR、7cF/11aR及F5/G2R等引物组合分别扩增TEF、RPB2-1、RPB2-2及RPB1基因片段并进行测序；序列经CodonCode Aligner处理并与NCBI GenBank数据库比对，选取61株涵盖16个种复合体的Fusarium参考序列，利用MAFFT v7（G-INS-i算法）进行多基因联配，通过raxmlGUI 1.5采用最大似然法（Maximum Likelihood, GTR+G模型，1000次自举）构建系统发育树；针对F. citricola种复合体（Fusarium citricola species complex, FCCSC）额外增加RPB1的四基因分析；对FCCSC内分离物在PDA、合成低营养琼脂（Synthetic Low-Nutrient Agar, SNA）及石竹叶琼脂（Carnation Leaf Agar, CLA）上进行形态学观察（菌落生长速率、分生孢子与厚垣孢子特征）；选取F. celtidicola分离物进行伤口接种致病力测试，以Diplodia seriata与Neofusicoccum parvum为阳性对照，无菌PDA为mock对照，6周后评估木质部褐变情况。
研究结果如下：
Sequence analyses
研究人员对19株单孢菌株进行多基因（TEF、RPB2-1、RPB2-2）系统发育分析，揭示其属于7个物种、涵盖6个种复合体。F. clavus（F. incarnatum-equiseti species complex, FIESC）在所有感染样本中均被一致分离，出现频率最高且可单独或与其他Fusarium物种共存；其余物种各仅见于单一植株：F. verticillioides（F. fujikuroi species complex, FFSC）、F. sambucinum与F. culmorum（F. sambucinum species complex, FSAMSC）、F. inflexum（F. oxysporum species complex, FOSC）、F. negundinis（隶属F. tricinctum species complex, FTSC，曾报道为FTSC 14）以及F. celtidicola（FCCSC）。针对FCCSC分离物补充RPB1的四基因分析确认了其F. celtidicola的身份与系统发育位置。
Morphology (F. celtidicola)
研究人员详细检视了FCCSC分离物的无性形态。暗培养下PDA菌落白色、全缘；光暗交替或连续白光下菌落中央亮橙色、产白色气生菌丝，背面淡橙，15°C至30°C下平均径向生长速率1.3–2.5 mm/天，暗处不产孢，光周期下5天始产孢。于CLA上5天形成橙色分生孢子座（sporodochia），分生孢子梗不分枝或分枝，具顶生或侧生单瓶梗（monophialides）。分生孢子座大分生孢子（macroconidia）细长、背腹微弯，顶端钝至微钩、足细胞发达，多为3隔（平均43.2±2.7 μm × 5±0.4 μm），偶见4–5隔；微孢子（microconidia）极少见，0–1隔；厚垣孢子（chlamydospores）椭圆形，间生于气生菌丝，单生偶链状，平均15.5±2.5 μm × 13.2±2 μm，形态总体与已发表F. celtidicola描述相符但分生孢子尺寸略有差异。
Pathogenicity test (F. celtidicola)
研究人员对3株F. celtidicola（3.3 L/3、3.3 M/2A、3.3 V）进行接种测试，9支接种枝中仅2支（均接种3.3 L/3）在6周后显示木质部浅褐变色，表明该分离物未表现强致病性，仅具轻微致病潜力，符合Fusarium属生活型介于内生菌至弱病原菌之间的特征。
讨论部分总结：研究人员通过多基因测序将匈牙利Thuja occidentalis与Chamaecyparis sp.病样中的Fusarium分离物鉴定至种级，所有分离物均源自具典型真菌侵染症状的植株，其观测症状至少部分可归因于此等Fusarium分离物，但可能受其他病原与因素共同影响。所检出的所有种复合体均含已知木本植物溃疡病原，如FFSC中的F. circinatum（松树脂溃疡病）、F. verticillioides（扁桃溃疡）、F. annulatum（无花果溃疡）；FIESC中的F. compactum（多种柏科及松属溃疡）；FSAMSC中的F. sambucinum（umbra树溃疡）；FOSC中的F. oxysporum（开心果根砧颈腐与茎溃疡）；FCCSC中的F. citricola与F. salinense（柑橘溃疡）。反复检出的F. clavus为广布种，此前报道宿主为谷物、野生草、马铃薯及人类，本研究首次记录其于Thuja occidentalis与Chamaecyparis sp.，其余6种Fusarium亦为首次在此二类宿主上报道，拓展了多分类元宿主范围认知。FCCSC内F. celtidicola形态大体吻合文献，致病性测试仅部分枝条褐变，暗示其可能为弱病原菌或条件致病的内生/腐生菌，其致病性可能依赖环境与宿主因子；该物种此前仅知源于Celtis australis死木与Angelica sinensis茎，本次分离自亲缘较远的Thuja occidentalis，支持其非单纯腐生/内生而具轻度致病性。由于FCCSC物种界定困难，单凭TEF无法可靠区分F. celtidicola、F. juglandicola及近期重分类的43株分离物，突显多基因分析与多位点测序或全基因组对种界划分与正确鉴定的必要。综上，本研究揭示了匈牙利观赏针叶树上Fusarium物种的意外高多样性（7种、6复合体），首次记录F. clavus与此前罕见F. celtidicola于此宿主，扩展了Fusarium分类元宿主范围知识，增进了对观赏针叶树相关Fusarium多样性、生态及潜在致病性的理解。
研究结论部分原文翻译：总体而言，本研究揭示了匈牙利北美香柏（Thuja occidentalis）与扁柏属（Chamaecyparis）树木相关的镰刀菌（Fusarium）物种具有出乎意料的高多样性。共分离出七种镰刀菌（Fusarium），包括本研究首次在这些宿主上鉴定出的反复检出物种Clavus镰刀菌（Fusarium clavus），以及此前极少被检测到的Celtidicola镰刀菌（Fusarium celtidicola）。研究人员的发现扩展了若干镰刀菌（Fusarium）分类单元当前的宿主范围知识，并有助于更全面地理解与观赏针叶树相关的镰刀菌（Fusarium）物种的多样性、生态及潜在致病性。
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