使用翻译融合在植物线粒体中表达功能性肺炎克雷伯氏菌固氮酶还原酶（NifH）

《Plant Molecular Biology》：Use of translational fusions to express functional Klebsiella oxytoca dinitrogenase reductase in plant mitochondria

　　

用生物固氮途径改造农作物是现代农业的长期目标。固氮酶还原酶（NifH）是生物固氮途径的关键组分，在金属辅因子装配和催化中具有多重作用。该酶必须以可溶性同源二聚体形式正确折叠，并装载[4Fe-4S]金属簇才能发挥功能。先前的研究发现，肺炎克雷伯氏菌（Ko）和棕色固氮菌（Av）的NifH在靶向植物线粒体时大多不可溶。本研究中，研究人员发现，将两个KoNifH或AvNifH单体进行翻译融合，形成KoNifHH或AvNifHH合成二聚体，当靶向植物线粒体并与推测的肽基脯氨酰顺反异构酶NifM共表达时，可产生可溶性蛋白。在常氧条件下于叶片线粒体中表达后分离的KoNifHH显示出一定的乙炔还原活性，该活性不需要共表达固氮酶特异性金属簇机器NifS和NifU。在用重组NifU进行体外铁硫簇重建后，该活性增加。在一项平行研究中，研究人员测试了一种变体铁-only固氮酶还原酶（AvAnfHv6）单体的翻译融合，该单体从植物线粒体分离时虽可溶但无活性（AvAnfHHv6）（Gregg et al. 2025a）。AvAnfHHv6从植物线粒体分离时丰度高且完全可溶，与其单体类似。AvAnfHHv6分离时无活性，但可通过体外铁硫簇重建被大幅激活。本研究证明了翻译融合如何帮助改善可溶性，并具有在植物线粒体内产生活性NifH酶的潜力。

**论文解读文章：通过翻译融合策略在植物线粒体中表达功能性固氮酶还原酶**

**研究背景与问题**

现代农业高度依赖哈伯-博斯法合成的氮肥，该过程能耗极高且导致环境问题，如氧化亚氮排放和水体富营养化。生物固氮（BNF）作为可持续替代方案，由固氮微生物利用固氮酶在常温常压下将N₂还原为NH₃。近年来，合成生物学的发展推动了将固氮酶引入植物的尝试，以减少合成氮肥的使用。固氮酶包含三种已知系统（MoFe、FeFe、VFe），其共同催化组分包括固氮酶（如NifDK）和固氮酶还原酶（如NifH）。NifH是关键的电子供体，参与金属辅因子装配和催化，需以可溶性同源二聚体形式存在并装载[4Fe-4S]簇。然而，先前研究表明，将肺炎克雷伯氏菌（Ko）和棕色固氮菌（Av）的NifH靶向植物线粒体时，蛋白质大多不可溶。为解决这一问题，一些研究筛选了来自嗜热菌的NifH变体，或通过理性设计AvAnfH变体以改善异源表达可溶性，但活性仍有限。本研究的核心问题是如何在植物线粒体中实现NifH的可溶性表达并维持功能，尤其关注二聚体形成和铁硫簇装载这两个瓶颈。

**研究目的与内容**

研究人员假设，将两个NifH单体通过翻译融合（translational fusion）形成人工二聚体，可能通过物理邻近性促进正确折叠和可溶性，从而在植物线粒体中产生功能性NifH。为此，他们构建了KoNifH和AvNifH的翻译融合体（分别命名为KoNifHH和AvNifHH），并测试了与伴侣蛋白NifM共表达对可溶性的影响。进一步，他们从本氏烟草（*Nicotiana benthamiana*）叶片线粒体中纯化这些融合蛋白，通过乙炔还原法（ARA）评估其活性，并探究铁硫簇装载是否需要固氮酶特异性蛋白NifS和NifU。此外，针对FeFe系统变体AvAnfHv6，他们也构建了翻译融合体AvAnfHHv6，并比较其与单体形式的活性差异。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术：利用Golden Gate组装构建植物表达载体，将两个NifH或AnfH单体通过寡肽接头（ArsA接头或Twin-Strep-tag?）翻译融合，并融合线粒体靶向肽（MTP，如拟南芥γATP酶前51个氨基酸或酵母CoxIV前29个氨基酸）以靶向线粒体；通过农杆菌（*Agrobacterium tumefaciens*）介导的本氏烟草叶片瞬时表达系统进行蛋白质表达（样本来源：5-6周龄本氏烟草，生长于光暗循环16:8 h，24°C）；使用Western blot分析可溶性与不溶性组分；在厌氧条件下通过Strep-Tactin?亲和层析纯化目标蛋白；采用乙炔还原法（ARA）测定固氮酶还原酶活性；利用SWATH质谱进行蛋白质组学分析；使用AlphaFold 3预测蛋白质结构并进行RMSD比对；在*E. coli*中构建含完整肺炎克雷伯氏菌* nif*操纵子的质粒，通过固氮生长测试验证融合蛋白的体内功能。

**研究结果**

**1. 两个KoNifH单体的翻译融合体在与KoNifM共表达并靶向植物线粒体时可溶**

研究人员发现，单体KoNifH在本氏烟草线粒体中不可溶，与KoNifM共表达仅略微增加可溶性。但构建的翻译融合体KoNifHHv1（含ArsA接头）单独表达时仅微溶，与KoNifM共表达后变为大部分可溶，且该效应具有特异性（GFP对照无影响）。加入NifS和NifU不改变可溶性。第二种版本KoNifHHv2（以Twin-Strep-tag?为接头）在共表达KoNifM时同样变为大部分可溶。通过构建分子量对照（失活MTP和胞质定位），Western blot显示融合蛋白被线粒体加工肽酶（MPP）有效切割，证实成功靶向线粒体基质。

**2. 两个AvNifH单体的翻译融合体在植物线粒体中也可溶**

AvNifHH（ArsA接头）在本氏烟草线粒体中部分可溶，但丰度低于KoNifHHv2。AlphaFold 3预测显示，接头不影响NifH折叠（RMSD 0.87-1.5 ?，TM评分0.91-0.98）。由于AvNifHH丰度低，后续功能分析聚焦于KoNifHHv2。

**3. 胞质表达的NifM可溶解靶向线粒体的KoNifHH**

当KoNifHHv2与胞质定位的KoNifM共表达时，其可溶性几乎与线粒体靶向NifM共表达时相当。AvNifHH也有类似现象。这表明NifM在NifHH进入线粒体基质前即发挥作用。

**4. 翻译融合体Nb-KoNifHHv2与Nb-KoNifM共表达后部分具有功能**

从本氏烟草叶片纯化的Nb-KoNifHHv2（与MTP-KoNifM共表达）在ARA中显示活性，产生乙烯速率为37 nmol/min/mg NifDK，约为阳性对照（AvNifH）的2%。共表达AvNifS和AvNifU未提高活性（22 nmol/min/mg）。但经体外与化学装载铁硫簇的Ec-AvNifU孵育后，活性升至98 nmol/min/mg（约8%对照），提高约4倍。这表明部分蛋白在分离时已含[4Fe-4S]簇，但更多蛋白可通过体外重建激活。

**5. KoNifHHv2在*E. coli*中支持肺炎克雷伯氏菌* nif*系统的固氮生长**

在*E. coli*中，用KoNifHHv2替换野生型KoNifH的完整* nif*操纵子，可在无氮培养基上支持厌氧固氮生长，生长水平与野生型相当，而终止密码子突变体则无生长。证明KoNifHHv2在体内保留了NifH的电子传递和金属簇成熟功能。

**6. 两个AvAnfH单体的翻译融合体在植物线粒体中也可溶**

野生型AvAnfH融合体（AvAnfHHwt）仅部分可溶。但变体AvAnfHv6的翻译融合体AvAnfHHv6（含TTm终止子）在本氏烟草线粒体中完全可溶，且被MPP有效加工。纯化产量达10 mg/kg鲜叶，纯度约70%，远高于KoNifHHv2。

**7. Nb-AvAnfHHv6从植物线粒体纯化后无活性，但可被体外激活**

Nb-AvAnfHHv6在ARA中分离时无乙烯产生。但经体外与Ec-AvNifU孵育后，活性达到218 nmol/min/mg NifDK，与细菌AvAnfH对照（225 nmol/min/mg）相当。表明该蛋白折叠正确，但缺乏[4Fe-4S]簇，可通过体外重建完全激活。

**总结与讨论**

本研究证明，通过翻译融合两个NifH单体，并共表达伴侣蛋白NifM，可在植物线粒体中产生可溶性且部分活性的固氮酶还原酶。KoNifHH的活性不依赖NifS/NifU，提示植物线粒体自身铁硫簇装配系统（ISC）可部分装载[4Fe-4S]簇。但活性较低，体外重构可显著提高，表明铁硫簇供给是主要瓶颈。AvAnfHHv6分离时无活性但可被完全激活，可能因FeFe系统对氧更敏感。研究还发现NifM主要在胞质中作用于NifHH，但最终活性需要线粒体基质内的进一步加工。这些结果突出了翻译融合策略在改善植物线粒体中异源蛋白可溶性方面的潜力，并为构建植物固氮途径提供了重要步骤。未来需要解决铁硫簇高效供给和氧保护问题，以实现完全活性的NifH在植物中的稳定表达。