转录因子SbbHLH168通过协调离子稳态和木质素含量增强高粱耐盐性

《Stress Biology》：The transcription factor SbbHLH168 enhances salt tolerance by coordinating ion homeostasis and lignin content in sorghum

　　

土壤盐渍化是对作物生产力日益增长的全球威胁。在此，研究人员证明高粱（sorghum）bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子SbbHLH168是盐胁迫耐受性的中心调节因子。SbbHLH168定位于细胞核，在所有器官中组成型表达，并受NaCl快速上调。在拟南芥或高粱中过表达SbbHLH168赋予明显更高的生物量保留、更长的根、更低的相对电导率、更少的超氧化物和H₂O₂积累，以及通过减少Na⁺积累而降低的Na⁺/K⁺比值，而VIGS（病毒诱导的基因沉默，Virus-Induced Gene Silencing）沉默组则表现出相反的表型。qRT-PCR和生化实验证明，SbbHLH168上调关键木质素生物合成基因（SbC4H、SbF5H、SbCOMT1），并在盐胁迫下增加根木质素含量，从而增强细胞壁完整性并限制离子泄漏。此外，酵母双杂交（Y2H）和BiFC（双分子荧光互补，Bimolecular Fluorescence Complementation）实验证实SbbHLH168与SbbHLH35在细胞核中相互作用，表明SbbHLH168的功能活性依赖于与SbbHLH35的异源二聚化。总之，SbbHLH168整合了离子稳态、ROS（活性氧，Reactive Oxygen Species）清除和木质素含量以赋予耐盐性，为培育强健高粱品种的分子育种提供了直接的基因靶标。

土壤盐渍化是全球作物生产面临的主要威胁，限制农作物生长并降低产量。高粱（Sorghum bicolor L.）作为C4禾谷类作物，具有较高的光合效率和环境适应性，尤其在盐渍化边际土地上展现出优于其他主粮作物的耐盐潜力。然而，其耐盐性分子机制尚未完全阐明，特别是bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子家族在高粱盐适应中的调控网络研究不足。bHLH是植物第二大转录因子家族，参与离子转运、ROS清除、渗透调节等耐盐过程，但高粱中仅有少数成员如SbbHLH85（负调控因子）被功能鉴定。因此，研究人员开展本研究，旨在鉴定高粱中关键bHLH基因SbbHLH168的功能，阐明其调控耐盐性的分子机制，为分子育种提供直接基因靶标。该研究论文发表在《Stress Biology》。

研究人员为开展研究主要采用了以下关键技术方法：系统发育分析（邻接法构建NJ树，bootstrap 1000次）、亚细胞定位（GFP融合蛋白在烟草叶片中瞬时表达，DAPI染色共定位）、GUS组织化学染色（proSbbHLH168:GUS转基因拟南芥及烟草瞬时表达）、qRT-PCR（检测基因表达及NaCl时间响应）、过表达与基因沉默（拟南芥花浸染法转化、高粱发根农杆菌（Rhizobium rhizogenes，菌株K599）介导的毛状根转化获得SbbHLH168-OE，以及VIGS（病毒诱导的基因沉默）技术构建pTRV2-SbbHLH168敲低植株，样本队列来源为拟南芥Col-0和高粱BTx623）、生理指标测定（火焰光度计测Na⁺/K⁺含量、相对电导率（REC）、木质素含量（乙酰溴法）、NBT（氯化硝基四氮唑蓝）和DAB（3,3'-二氨基联苯胺）染色检测ROS）、酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）验证蛋白互作。

研究结果如下：

**SbbHLH168是一个盐诱导的bHLH转录因子**：通过系统发育分析发现SbbHLH168与玉米（Zea mays）和荻（Miscanthus lutarioriparius）同源关系最近，其HLH结构域（第37-106位氨基酸）高度保守，三维结构呈V形二聚体。亚细胞定位实验显示SbbHLH168-GFP融合蛋白仅在细胞核中积累（与DAPI共定位）。组织特异性表达分析（proSbbHLH168:GUS转基因拟南芥及公开转录组数据）表明其在根、叶、花、果荚中普遍表达，且qRT-PCR证实高粱根中SbbHLH168转录本在NaCl处理后3小时达到峰值。

**过表达SbbHLH168增强拟南芥耐盐性**：在100 mM NaCl处理下，SbbHLH168过表达（OE）拟南芥株系（OE-18、OE-23、OE-27）相比野生型（WT）表现出更绿的叶片和更健壮的生长，地上部和根部鲜重及干重显著更高，根长更长。NBT和DAB染色显示OE株系ROS积累更少，Na⁺含量和Na⁺/K⁺比值显著降低，K⁺含量无显著差异，相对电导率（REC）降低，表明SbbHLH168通过提高抗氧化能力、维持离子稳态和膜稳定性增强耐盐性。

**SbbHLH168增强高粱耐盐性**：通过发根农杆菌介导的毛状根转化获得SbbHLH168-OE高粱，在150 mM NaCl处理7天后，三个独立OE组（OE-1、OE-2、OE-3）根长、鲜重和干重均显著高于对照，Na⁺含量和Na⁺/K⁺比值降低，K⁺含量略高。相反，VIGS沉默SbbHLH168（pTRV:SbbHLH168）导致高粱盐敏感性增强，根长、鲜重、干重和株高显著降低，Na⁺含量和Na⁺/K⁺比值升高，K⁺含量呈下降趋势（未达显著），证实SbbHLH168是耐盐性所必需的。

**SbbHLH168与SbbHLH35互作**：酵母双杂交（Y2H）实验显示pGBKT7-SbbHLH168与pGADT7-SbbHLH35共转化后能在四缺培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）上生长并显蓝色，表明二者互作。qRT-PCR显示SbbHLH35在NaCl处理后显著上调，且耐盐品种M-81E的SbbHLH35本底表达水平显著高于盐敏感品种Roma。BiFC实验进一步证实SbbHLH168-YCE与SbbHLH35-YNE共表达仅在细胞核中产生强YFP荧光，阴性对照无荧光，说明两者在体内外均特异性结合。

**SbbHLH168调控木质素生物合成以增强耐盐性**：qRT-PCR分析盐胁迫下SbbHLH168-OE高粱中胁迫相关基因表达，发现ABA信号通路相关基因（SbNCED3、SAPK10、SbBGLU22）和关键木质素生物合成基因（SbC4H、SbF5H、SbCOMT1）均显著上调，其中SbF5H上调幅度最大。木质素含量测定显示，正常条件下OE与WT无差异，但150 mM NaCl处理后所有组木质素含量均增加，且OE组增幅显著大于WT，表明SbbHLH168通过上调木质素合成基因增加木质素积累，从而增强细胞壁屏障、限制离子泄漏。

讨论部分总结：SbbHLH168作为正调控因子，与负调控因子SbbHLH85功能相反。序列比对显示其与Andropogoneae族同源度最高，而与水稻OsbHLH168相似度低（50.00），解释了功能差异。SbbHLH168通过多通路协同发挥作用：降低Na⁺积累和Na⁺/K⁺比值（与拟南芥、水稻中bHLH对离子转运的调控一致），减少ROS积累（通过抗氧化酶），并上调SbBGLU22（β-葡萄糖苷酶基因）可能参与ABA信号释放。最关键的发现是SbbHLH168促进木质素积累，这与其他物种中bHLH调控木质素的研究一致，但值得注意的是水稻OsbHLH034过表达虽增加木质素却导致盐敏感，研究人员推测可能由于木质素沉积的空间分布差异（凯氏带靶向性沉积有益，而皮层细胞异位沉积有害）。SbbHLH168与SbbHLH35的异源二聚化可能改变DNA结合特异性或靶基因激活能力，是其双重功能（离子稳态和木质素合成）的结构基础。

研究结论翻译：总之，本研究鉴定出SbbHLH168是高粱中的一个关键转录因子，它通过减少Na⁺积累、维持低Na⁺/K⁺比值以及缓解氧化胁迫显著增强耐盐性。值得注意的是，SbbHLH168上调关键木质素生物合成基因（SbC4H、SbF5H、SbCOMT1）以增加木质素含量，可能通过增强细胞壁屏障并限制胁迫下的离子泄漏来提高耐盐性。此外，SbbHLH168与SbbHLH35之间的相互作用揭示异源二聚化对其调控功能至关重要。这一发现为作物耐盐性分子设计直接利用提供了有价值的基因资源，并拓展了bHLH家族的功能边界。