整合多组学分析鉴定FAM3D作为宫颈癌中具预后价值的肿瘤抑制因子

《Functional & Integrative Genomics》：Integrative multi-omics analysis identifies FAM3D as a prognostic tumor suppressor in cervical cancer

　　

宫颈癌（Cervical cancer, CC）仍是全球女性主要的恶性肿瘤之一。表观遗传与转录失调使得识别具有预后与治疗相关性的因果基因变得复杂。研究人员采用基于汇总数据的孟德尔随机化（Summary data?based Mendelian randomization, SMR）整合表达数量性状位点（expression Quantitative Trait Loci, eQTL）与蛋白数量性状位点（protein Quantitative Trait Loci, pQTL）数据集，并结合全基因组关联研究（Genome?wide association study, GWAS）汇总统计量（ID: ukb?b?8777），以优先筛选与CC相关的候选基因。利用多个GEO队列进行差异表达分析，并通过临床标本免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）验证蛋白表达。借助GEO与TCGA数据集开展DNA甲基化谱分析与相关性分析以研究表观遗传调控。采用Kaplan–Meier与表达?甲基化联合生存分析评估预后意义。在HeLa细胞中通过FAM3D敲低或过表达后的伤口愈合与CCK?8实验进行功能验证。进一步行RNA测序探索FAM3D调控的下游分子通路。整合SMR分析将FAM3D鉴定为CC的保护性基因。FAM3D表达在CC组织中显著降低，并从正常宫颈组织到宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia, CIN）及浸润性CC呈进行性下降，经IHC进一步证实。FAM3D启动子高甲基化（cg26334888）与其转录下调相关，并与基因表达呈负相关。生存分析显示，高FAM3D表达（p＝0.016）与低启动子甲基化（p＝0.048）与更有利的总生存相关，而联合表达?甲基化分析进一步改善预后分层（p＝0.006）。功能实验表明FAM3D抑制CC细胞增殖与迁移。转录组谱揭示FAM3D恢复诱导广泛转录重编程，并与炎症信号、细胞因子介导通路及细胞外基质重塑相关。FAM3D下游鉴定的关键枢纽基因包括CXCL8、MMP1、EREG与LCN2。FAM3D是CC中潜在的肿瘤抑制因子与预后生物标志物，其表达部分受启动子甲基化调控。整合多组学分析与功能研究提示，FAM3D可能通过调节炎症信号与细胞外基质相关通路抑制CC进展。这些发现为CC的分子机制提供了新见解，并支持FAM3D作为预后生物标志物与治疗靶点的潜在临床用途。

研究背景方面，宫颈癌（Cervical cancer, CC）在2022年仍是全球女性中第四常诊断的癌症，并导致女性癌症相关死亡人数第四高，尽管过去三十年发病率有所下降，仍是重大全球健康负担。持续性高危人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染被认为是宫颈前病变和CC的主要病因因素，伴随宿主与病毒基因组异常甲基化等表观遗传失调，破坏肿瘤抑制基因功能并促进CC进展。表观遗传机制在不改变DNA序列的情况下调控基因表达，对细胞分化等过程至关重要，但其在CC中导致的因果基因识别困难，限制了疾病机制阐明与有效疗法开发，因此亟需整合多组学方法优先筛选具因果作用的基因并明确其调控与预后价值。研究人员通过开展整合多组学分析，结合基于汇总数据的孟德尔随机化（Summary data?based Mendelian randomization, SMR）、差异表达、DNA甲基化、生存分析、细胞功能实验与转录组测序，鉴定FAM3D为CC保护性基因，明确其表达随正常宫颈、宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia, CIN）至浸润性CC逐步降低，受启动子高甲基化（cg26334888）调控并影响总生存，功能上抑制HeLa细胞增殖与迁移，下游涉及炎症信号、细胞因子介导通路、细胞外基质重塑及CXCL8、MMP1、EREG、LCN2等枢纽基因，结论支持FAM3D作为CC潜在肿瘤抑制因子、预后生物标志物与治疗靶点，该论文发表在《Functional 》。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：基于SMR整合eQTL（来自eQTLGen联盟血液样本数据）、pQTL（来自INTERVAL、Fenland、SCALLOP研究）与GWAS（IEU Open GWAS数据库ID: ukb?b?8777，462?933例欧洲人群）以优先筛选候选基因；从GEO获取GSE138080、GSE63154、GSE287994及TCGA?CC（288例CC样本）的mRNA、DNA甲基化与临床数据进行差异表达、甲基化差异与相关性分析；采用limma包筛选差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）并以韦恩图交叉SMR与DEGs；通过广州医科大学第一医院15例临床标本（正常、CIN、CC各5例）行免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）用H?score评估蛋白表达；基于TCGA?CC用surv_cutpoint确定截断值行Kaplan–Meier与联合表达?甲基化生存分析；在HeLa细胞行FAM3D敲低（shRNA）与过表达（质粒）后CCK?8与伤口愈合实验；对过表达FAM3D的HeLa细胞行RNA测序，进行差异表达、GO、KEGG、WikiPathways富集与蛋白?蛋白相互作用（Protein–protein interaction, PPI）网络分析。

研究结果部分保留小标题并说明研究与结论如下：

Association of eQTL_eQTLgen with CC：研究人员用SMR分析eQTLGen的9169个eQTLs与CC GWAS，经HEIDI检验（P_HEIDI＞0.05）筛选出406个与CC有因果关联的eQTLs，其中MTFP1、SRGAP1、PANX2与CC风险呈显著负向因果（p＜0.001），MED8、ALOX5AP、ATRAID、ELOVL1、MPL、KRTCAP3呈显著正向因果（p＜0.001），曼哈顿图与火山图展示关联。

Association of pQTLs with CC：研究人员用SMR分析1716个pQTLs，发现68个与CC有因果关联，27个正向、41个负向因果关联，圈热图展示pQTLs?CC SMR阳性结果。

Screening of DEGs and key genes selection：研究人员从GEO获取GSE138080（252个DEGs：147下调、105上调）与GSE63154（946个DEGs：556下调、390上调），用limma筛选（log₂|fold change|＞1，调整p＜0.05，FDR＜0.05），韦恩图交叉SMR（eQTL/pQTL保护性基因为beta＜0，风险基因为beta＞0）与DEGs，唯一重叠基因为FAM3D（在CC中一致下调且与疾病有因果关联），无上调基因重叠。

FAM3D downregulation associated with CC progression：研究人员分析GSE138080与GSE63514，FAM3D表达在正常宫颈最高、CIN中等、CC最低，呈逐步下降；IHC对15例临床标本（正常、CIN、CC各5）染色显示蛋白强度随疾病加重递减，H?score量化验证mRNA与蛋白水平均在CC进展中下调。

Differential methylation and correlation analysis of FAM3D promoter probes：研究人员用GSE287994（Illumina MethylationEPIC 850?K）经ChAMP鉴定FAM3D相关8个CpG探针在肿瘤中高甲基化（Δβ＞|0.2|，校正p＜0.05），选TSS1500区cg26334888与cg21770617用TCGA?CC行Spearman相关，cg26334888与FAM3D mRNA显著负相关（r＝?0.162，p＝0.006），cg21770617不显著（r＝?0.054，p＝0.360），提示cg26334888可能通过启动子高甲基化调控转录抑制。

Survival analysis of FAM3D expression and promoter methylation：研究人员用TCGA?CC行总生存（Overall survival, OS）分析，高FAM3D表达OS更长（p＝0.016），高cg26334888甲基化OS更短（p＝0.048）；联合分为四组（高表达＋低甲基化、高表达＋高甲基化、低表达＋低甲基化、低表达＋高甲基化），Kaplan–Meier显示高表达＋低甲基化生存最优，低表达＋高甲基化最差（p＝0.006）。

Functional validation of FAM3D in CC progression：研究人员在HeLa细胞用shRNA敲低与质粒过表达FAM3D（qPCR验证效率），伤口愈合显示敲低加速闭合（p＝0.049），过表达抑制闭合（p＝0.002）；CCK?8显示敲低增强增殖（36?h p＝0.007），过表达降低增殖（p＝0.002），表明FAM3D抑制CC细胞迁移与增殖，具体外肿瘤抑制作用。

FAM3D restoration induces extensive transcriptomic remodeling in CC cells：研究人员对FAM3D过表达HeLa细胞行RNA测序，PCA等显示重现性好；鉴定差异表达基因（调整p＜0.05，|log₂ fold change|＞1），热图显示转录景观改变，雷达图突出CXCL8、MMP1、EREG、LCN2显著失调；GO富集为细胞外基质组织、细胞因子介导信号、受体?配体互作、对外刺激反应；KEGG与WikiPathways富集炎症、免疫、细胞外基质相关通路（细胞因子?细胞因子受体互作、IL?17信号、TNF信号）；PPI网络显示CXCL8、MMP1、EREG、LCN2为高度连接枢纽基因，提示FAM3D通过协调炎症信号与细胞外基质相关通路抑制肿瘤进展。

讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，本研究用整合多组学框架（SMR因果推断＋转录组、表观遗传、功能分析）表征FAM3D在CC中的作用，FAM3D为保护性基因，从正常宫颈到CIN至浸润性CC逐步降低，启动子高甲基化促成下调，低表达与高甲基化关联不良预后，功能实验支持其肿瘤抑制作用。FAM3D属FAM3家族（FAM3A、FAM3B、FAM3C、FAM3D），肠道分泌蛋白，通过FPR1/FPR2维持黏膜稳态，缺失加速结肠炎相关结直肠癌，在头颈鳞癌常沉默且高表达预测更好生存，与本研究发现一致。表观遗传中DNA甲基化由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）催化，肿瘤早期全基因组低甲基化伴CpG岛高甲基化沉默抑癌基因，本研究TCGA与GEO显示FAM3D启动子甲基化与转录负相关的关联，去甲基化恢复表达，高cg26334888甲基化预示更差预后，但当前为相关性，需甲基化修饰剂或位点特异性编辑验证因果。FAM3D高表达在多种癌为有利预后，但在子宫内膜癌、低级别胶质瘤等为不利，显示上下文依赖性。本研究转录重编程关联炎症信号与细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）相关通路，CXCL8促肿瘤微环境与转移，MMP1介导ECM降解促侵袭，LCN2促上皮?间质转化（Epithelial–mesenchymal transition, EMT）与侵袭，EREG参与微环境信号，支持FAM3D为炎症与促肿瘤转录网络的上游调控者。研究优势在于整合eQTL/pQTL?SMR与多组学、多GEO队列、IHC、TCGA生存与RNA?seq增强可信度；局限在于IHC为单中心小样本，缺乏CIN甲基化数据集，转录发现为关联性，需更多细胞动物模型与多中心大队列验证临床用途。

研究结论部分翻译：总之，本研究鉴定FAM3D为宫颈癌中潜在的肿瘤抑制因子与预后生物标志物。整合多组学分析揭示FAM3D表达部分受启动子甲基化调控，且FAM3D表达降低与不良临床结局相关。功能实验表明FAM3D抑制宫颈癌细胞增殖与迁移，而转录组谱进一步提示炎症信号与细胞外基质重塑为潜在下游机制。综上，这些发现为FAM3D在宫颈癌进展中的生物学作用提供了新见解，并支持其作为预后生物标志物与治疗靶点的潜在用途。