综合转录组学和组织验证分析鉴定与银屑病中鞘脂代谢和免疫重塑相关的棕榈酰化相关生物标志物

《Frontiers in Immunology》：Integrated transcriptomic and tissue-validation analyses identify palmitoylation-associated biomarkers linked to sphingolipid metabolism and immune remodeling in psoriasis

　　

背景：银屑病是一种慢性免疫介导的炎症性皮肤病，以表皮功能障碍、异常角质形成细胞激活和复杂免疫重塑为特征。尽管脂质失调在银屑病中日益被涉及，但棕榈酰化相关基因在皮肤炎症中的作用仍不明确。方法：研究人员整合了批量转录组数据集（GSE14905、GSE13355和GSE121212）以及一个单细胞RNA测序数据集（GSE151177），以鉴定银屑病中棕榈酰化相关生物标志物。应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达分析以及包括LASSO和SVM-RFE在内的机器学习算法筛选核心基因。随后进行了功能富集、免疫微环境分析、调控网络构建和候选药物预测。此外，使用RT-qPCR验证候选基因在银屑病皮损皮肤和健康对照皮肤中的表达。结果：研究人员鉴定了209个棕榈酰化相关差异表达基因，并筛选出五个候选核心基因：CERK、SPTSSA、TNFSF10、CTNS和HSD17B10。外部验证支持SPTSSA、TNFSF10、CTNS和HSD17B10的相对稳健性，而CERK仍保留为生物学相关的机制候选。由SPTSSA、TNFSF10、CTNS和HSD17B10衍生的四基因评分定义了一个高评分状态，富集于炎症、增殖和代谢应激通路，包括干扰素应答、IL-6–JAK–STAT3信号通路、通过NF-κB的TNF信号通路、补体和炎症应答。免疫去卷积进一步揭示巨噬细胞和活化树突状细胞浸润增加，同时多个免疫检查点分子协同上调。单细胞和相关性分析提示，SPTSSA在基底细胞和角质形成细胞中表达相对较强，支持其与表皮程序的更紧密关联。CTNS也表现出主要表皮分布，特别是在角质形成细胞中，而TNFSF10显示出更偏向免疫的模式，HSD17B10在多种细胞群体中表现出更广泛的免疫代谢分布。RT-qPCR进一步支持皮损中SPTSSA和HSD17B10的上调，而CERK显示出相反的组织水平趋势，因此保留为机制信息候选。结论：本研究鉴定了一种与银屑病中鞘脂代谢、角质形成细胞激活和免疫重塑相关的棕榈酰化相关分子特征。这些发现不仅为疾病分层提供了候选生物标志物，还突出了潜在的可药化通路和治疗靶点，为未来的转化研究奠定基础。

**论文解读：银屑病中棕榈酰化相关生物标志物的整合转录组学与组织验证分析**

**1. 研究背景与问题**

银屑病（Psoriasis）是一种慢性、复发性、免疫介导的炎症性皮肤病，其病理机制涉及表皮功能障碍、异常角质形成细胞（keratinocyte）激活以及复杂的免疫重塑。尽管经典的细胞因子回路（如IL-23/IL-17/TNF通路）被认为是核心驱动因素，但越来越多的证据表明，脂质代谢失调在银屑病中扮演重要角色，包括神经酰胺含量降低、鞘脂代谢异常以及表皮屏障缺陷。然而，棕榈酰化（palmitoylation）——一种可逆的脂质修饰，通过将棕榈酸共价连接至靶蛋白，影响其膜定位、稳定性及信号转导——在银屑病皮肤炎症中的具体作用仍不明确。现有研究虽已利用机器学习方法鉴定出一些候选生物标志物，但大多未将其置于棕榈酰化或鞘脂代谢的生物学背景下进行整合分析。因此，本研究旨在通过整合批量转录组数据、单细胞数据、机器学习优先排序、免疫微环境分析及组织水平RT-qPCR验证，系统鉴定银屑病中棕榈酰化相关的候选生物标志物，并探索其与鞘脂代谢、表皮激活及炎症免疫重塑的关联。

**2. 主要关键技术方法**

研究人员整合了三个批量转录组数据集（GSE14905、GSE13355和GSE121212）以及一个单细胞RNA测序数据集（GSE151177），均来自基因表达综合数据库（GEO）。主要方法包括：使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定银屑病相关模块；通过差异表达分析（limma包）筛选差异表达基因；应用LASSO回归和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）进行特征选择以确定核心基因。随后进行功能富集分析（GO、KEGG、GSEA、GSVA）、免疫微环境分析（多种去卷积算法，如CIBERSORT、ESTIMATE等）、调控网络构建（基于hTFtarget和miRWalk的转录因子及miRNA预测）以及候选药物预测（基于CTD数据库）。组织验证使用RT-qPCR检测5例银屑病皮损皮肤和4例健康对照皮肤（来自上海皮肤病医院伦理委员会批准）。

**3. 研究结果**

**3.1 WGCNA 鉴定银屑病相关共表达模块**
通过WGCNA分析，在GSE14905训练队列中，以软阈值功率11构建共表达网络，共鉴定出11个模块。其中绿色模块与银屑病状态呈最强正相关（cor = 0.92，p = 6 × 10^-23），且模块成员度与基因显著性呈强正相关，表明该模块为关键疾病相关模块，用于后续核心基因筛选。

**3.2 棕榈酰化相关差异表达基因的鉴定与功能特征**
差异表达分析共鉴定出3,877个差异表达基因（DEGs），其中1,890个上调、1,987个下调。将上调DEGs、WGCNA绿色模块基因及GeneCards来源的棕榈酰化相关基因（PRGs）取交集，得到209个棕榈酰化相关差异表达基因（Palm-DEGs）。GO富集分析显示这些基因主要富集于脂质代谢过程（如神经酰胺代谢过程、鞘脂代谢过程）、膜结构及氧化还原酶活性；KEGG通路分析显示富集于脂质与动脉粥样硬化、花生四烯酸代谢、NF-κB信号通路等。GSEA进一步证实其与细胞增殖、血管生成及炎症信号通路相关。

**3.3 机器学习优先排序五个候选核心基因**
基于209个Palm-DEGs，通过LASSO回归（10折交叉验证，保留13个基因）和SVM-RFE（5折交叉验证，最优特征数为5），取交集后得到五个共同候选核心基因：CERK、SPTSSA、TNFSF10、CTNS和HSD17B10。

**3.4 候选核心基因的表达模式与诊断性能在独立数据集中验证**
在训练集GSE14905中，五个基因均差异表达，ROC分析显示SPTSSA（AUC = 0.945）、TNFSF10（AUC = 0.890）、CTNS（AUC = 0.812）和HSD17B10（AUC = 0.965）诊断性能良好，CERK相对较低（AUC = 0.801）。在验证集GSE13355和GSE121212中，上述四个基因的表达趋势和ROC性能保持稳健（如GSE13355中SPTSSA的AUC = 0.999，GSE121212中TNFSF10的AUC = 0.990），而CERK在各数据集中表现较弱。因此，将SPTSSA、TNFSF10、CTNS和HSD17B10作为相对稳定的核心基因，CERK保留为机制候选。

**3.5 关键基因特征的功能富集分析揭示免疫炎症高评分状态**
基于四个稳定基因（SPTSSA、TNFSF10、CTNS、HSD17B10）通过ssGSEA计算每个样本的评分，并按中位数分为高评分组和低评分组。GSVA分析显示，高评分组显著富集于E2F靶点、G2M检查点、IFN-α/γ应答、IL-6-JAK-STAT3信号、TNFα通过NF-κB信号、补体、炎症应答、氧化磷酸化、糖酵解等通路；而低评分组富集于Wnt/β-catenin、TGF-β、Hedgehog信号及上皮间充质转化等。GO和KEGG分析进一步支持高评分组与细胞周期、免疫应答、DNA复制相关，低评分组与表皮发育、细胞分化、黏着斑相关。GSEA也证实高评分组富集免疫应答和角质包膜形成通路。

**3.6 免疫微环境分析揭示高评分组免疫浸润增强与检查点上调**
通过多种免疫去卷积算法（CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、ESTIMATE等），高评分组中巨噬细胞M0/M1、活化树突状细胞、活化CD4记忆T细胞、滤泡辅助T细胞等免疫细胞浸润显著增加，而静息肥大细胞和活化NK细胞减少。共刺激和共抑制免疫调节分子整体呈上调趋势，其中免疫检查点基因CD274（PD-L1）、CTLA4、LAG3、TIGIT显著升高，而PDCD1和HAVCR2无显著差异。ESTIMATE分析显示高评分组的免疫评分显著升高，但基质评分和ESTIMATE总体评分无差异，提示评分主要反映免疫细胞浸润差异。

**3.7 基于CTD的治疗网络分析突出SPTSSA相关候选化合物与转化意义**
通过CTD数据库构建疾病-基因-药物相互作用网络，鉴定出与SPTSSA相关的四种候选化合物：氯倍他索、环孢素、维A酸和叶酸。其中氯倍他索和环孢素是已知的抗银屑病药物，主要发挥抗炎和免疫调节作用；维A酸调节角质形成细胞增殖分化；叶酸作为辅助因子参与细胞代谢。这些化合物与免疫调节、炎症或角质形成细胞功能密切相关，提示SPTSSA在银屑病治疗网络中具有潜在核心地位。

**3.8 调控网络分析突出SPTSSA作为中心节点**
基于hTFtarget数据库和miRWalk预测，构建了miRNA-基因-转录因子调控网络。四个核心基因均连接多个转录因子（如SPI1、TFAP2C、FOXA2、KLF4）和miRNA（如hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-489-3p、hsa-miR-326）。其中SPTSSA与最多转录因子和miRNA相连，提示其作为整合调控网络中的中心节点，可能受到转录和转录后水平的共同调控。

**3.9 机制探索提示角质形成细胞优势及与炎症和鞘脂通路的关联**
在GSE14905中，对四个稳定基因与代表性细胞标志基因及银屑病相关通路进行Spearman相关性分析（仅显示|r| ≥ 0.3且p < 0.05的结果）。SPTSSA和CTNS与角质形成细胞标志物（KRT14、KRT5、KRT16）呈正相关，与成纤维细胞和内皮细胞标志物相关性弱或负，支持其表皮谱系优势。TNFSF10和HSD17B10与免疫细胞标志物（树突状细胞、巨噬细胞）相关性更强。在通路层面，SPTSSA与神经酰胺代谢、鞘脂生物合成、角质包膜、IL-6-JAK-STAT3、TNFα通过NF-κB、IL-17信号等呈广泛正相关，提示其与表皮分化、鞘脂代谢和炎症激活的紧密关联。CTNS共享部分表皮/炎症相关模式，而TNFSF10和HSD17B10更偏向免疫炎症模块。

**3.10 银屑病皮损中优先基因的单细胞景观与细胞类型特异性表达模式**
对GSE151177单细胞数据集进行质量控制后，保留12,679个细胞，通过Harmony去除批次效应，UMAP降维后注释为10种主要细胞类型（CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、髓系细胞、树突状细胞、角质形成细胞、基底细胞、内皮细胞、基质细胞、黑色素细胞）。点图显示SPTSSA在基底细胞和角质形成细胞中表达相对较强；CTNS主要富集于角质形成细胞；TNFSF10在T细胞和内皮细胞中表达较高；HSD17B10在髓系细胞、树突状细胞和T细胞中广泛分布，呈免疫代谢模式。

**3.11 RT-qPCR提供初步组织水平验证并揭示基因特异性异质性**
在5例银屑病皮损和4例健康对照皮肤中，SPTSSA和HSD17B10在皮损中显著上调，CTNS和TNFSF10未达到统计学显著差异。CERK在皮损中呈现与公共数据集相反的趋势（下调），因此被解释为机制信息候选而非核心组织验证生物标志物。

**4. 总结与讨论**

本研究结论部分翻译如下：总之，研究人员在银屑病中鉴定了一种棕榈酰化相关分子特征，并优先将SPTSSA、TNFSF10、CTNS和HSD17B10列为相对稳定的计算候选生物标志物，其中SPTSSA和HSD17B10获得了组织水平RT-qPCR的额外支持，而CERK保留为机制信息候选。该特征与鞘脂代谢、角质形成细胞功能障碍、髓系和淋巴系免疫重塑以及协调的免疫检查点诱导相关。这些发现为未来皮损/非皮损组织验证、蛋白质水平验证和银屑病机制导向的研究提供了一个临床相关且生物学一致的框架。讨论部分强调，本研究基于转录组整合和相关分析，应视为棕榈酰化关联而非直接验证的生物标志物；SPTSSA因其与角质形成细胞、鞘脂代谢和AHR信号的广泛关联而成为最生物一致的组织支持候选；HSD17B10也获得RT-qPCR验证；CTNS和TNFSF10在公共数据集中稳健但小组织队列未达显著，需进一步验证；CERK由于组织水平趋势相反被保留为机制候选。免疫微环境分析显示高评分组中免疫激活与抑制性检查点共存，可能反映高度炎症状态下的代偿性调节。研究局限性包括：PRG列表来源于GeneCards的广泛关联注释、仅关注上调DEGs可能遗漏重要下调基因、转录组关联不能证明直接蛋白棕榈酰化、组织验证队列小且无配对非皮损样本、候选药物仅基于数据库预测。总体而言，该研究提供了一个整合的生物学框架，将棕榈酰化相关改变与鞘脂代谢、表皮屏障紊乱和炎症免疫重塑联系起来，为后续转化研究奠定了基础。