营养剥夺增强RAW细胞中CD3表达并加剧CD3诱导的促炎表型，其过程与活化T细胞核因子（NFAT）和干扰素调节因子-1（IRF-1）相关

《Frontiers in Immunology》：Nutrient deprivation increases CD3 expression in RAW cells and augments the CD3-induced proinflammatory profile, associated with NFAT and IRF-1

　　

摘要

背景：髓系细胞（myeloid cells）可表达淋巴系标志物，包括CD3-TCR复合体的组成成分。CD3⁺巨噬细胞已在感染性与非感染性病理状态中被鉴定，但其来源及信号传导机制仍研究不足，主要原因在于其在人类样本中的丰度较低。研究人员采用小鼠RAW巨噬细胞系作为模型，旨在明确营养剥夺是否诱导CD3表达，并鉴定参与CD3依赖性促炎表型激活的信号分子。

方法：首先，评估环境应激，尤其是营养剥夺，在一段时间内对CD3表达的影响。随后，采用抗CD3和IgG2a刺激RAW细胞，在检测促炎性细胞因子谱的同时，评估包括活化T细胞核因子（NFAT）、c-Jun和IκB激酶（IKK）在内的信号蛋白表达。此外，还考察了干扰素调节因子-1（IRF-1）、GATA结合蛋白-3（GATA-3）和MAFB的转录调控。最后，通过吞噬实验测定CD3⁺ RAW细胞的功能能力。

结果：研究发现，RAW细胞表达传统上与T细胞相关的分子，包括CD3、T细胞受体（TCR）和CD4。值得注意的是，在营养剥夺条件下，CD3表达在蛋白水平和转录水平均显著上调，尽管尚未达到T细胞中的表达水平。在功能方面，CD3⁺ RAW细胞对乳胶微球表现出增强的吞噬活性。此外，抗CD3联合IgG2a刺激诱导了强烈的促炎性细胞因子应答，其特征为刺激后早至5 h即分泌γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-6（IL-6）。该反应与涉及NFAT、c-Jun和IKK的信号通路活化，以及IRF-1表达增加和MAFB下调相关，从而支持RAW细胞中CD3依赖性促炎表型的建立。

结论：研究结果确立了RAW巨噬细胞可作为研究髓系细胞中CD3⁺信号装置的模型。研究首次证明营养剥夺可诱导CD3表达，且由此产生的CD3驱动性促炎程序至少部分与NFAT和IRF-1相关。这些结论为理解CD3⁺巨噬细胞的来源及功能意义提供了新见解，并为探究该通路在多种病理背景下对先天免疫应答的影响提供了有价值的平台。

这篇发表于《Frontiers in Immunology》的研究聚焦于一个近年来逐渐受到重视的免疫学问题：部分髓系细胞，尤其是单核/巨噬细胞，能够表达传统上归属于淋巴细胞的受体分子，如CD3-T细胞受体（TCR）复合体。既往研究已在结核、肿瘤、动脉粥样硬化等多种病理环境中观察到CD3⁺巨噬细胞或单核细胞，但由于其在人类原代样本中比例较低，这类细胞的来源、形成条件以及信号转导机制仍不清楚。RAW 264.7小鼠巨噬细胞系中存在较高比例的CD3⁺细胞，因此可作为解析此类非经典髓系细胞的重要模型。该研究的核心问题是：环境性代谢压力，尤其是营养剥夺，是否会诱导RAW细胞增加CD3表达；在此基础上，CD3相关刺激是否会驱动明确的促炎程序，以及这一过程涉及哪些关键信号分子和转录因子。

目前该领域存在几个突出问题。首先，CD3/TCR分子出现在巨噬细胞中的生物学意义尚未厘清，既不清楚其是否仅代表异常转录现象，也不清楚其是否具有真实功能。其次，诱导CD3表达的环境因素缺乏系统研究，特别是病理组织内常见的低营养、低氧和代谢应激是否参与这一过程仍证据不足。再次，即便CD3在髓系细胞中具有功能，其下游信号是否沿用T细胞经典通路、还是形成了与巨噬细胞特性相结合的非经典模式，也有待阐明。因此，开展本研究有助于解释CD3⁺巨噬细胞在感染和炎症中的形成基础及其潜在效应机制。

研究人员围绕上述问题开展了系统分析。结果表明，RAW细胞本身即表达多种与T细胞相关的分子，包括CD3、TCR和CD4，其中CD3⁺细胞约占一半。进一步研究发现，CD3表达具有动态可塑性：随培养时间延长，其转录水平在72 h明显升高；在限制血清或改变丙酮酸供应的营养应激条件下，CD3蛋白和mRNA表达均进一步上调，同时细胞活率保持较高。功能上，CD3⁺ RAW细胞保留甚至表现出较强吞噬能力。更重要的是，抗CD3联合IgG2a刺激可诱导明显的促炎性细胞因子谱，包括早期IFN-γ、持续性TNF以及24 h左右达峰的IL-6，而IL-4、IL-5、IL-10和IL-2并未明显被诱导。信号机制方面，该反应伴随NFAT-1、p-c-Jun与IKK的早期激活，以及较晚出现的NF-κB升高；在转录调控层面，则表现为IRF-1早期上调、MAFB下调，而GATA-3在后期升高。研究据此提出，营养剥夺可诱导RAW细胞形成更高CD3表达状态，并使CD3相关刺激更易驱动促炎程序，这一程序至少部分与NFAT和IRF-1相关。该研究的重要意义在于，为CD3⁺髓系细胞提供了可操作的体外模型，并将代谢环境变化与非经典CD3/TCR样信号联系起来，拓展了对先天免疫可塑性的认识。

在技术方法方面，研究主要采用RAW 264.7小鼠巨噬细胞系作为实验模型，并以C57BL/6小鼠脾细胞作为CD3阳性对照。研究人员通过多参数流式细胞术检测CD3、TCRβ、CD4、CD8、CD28和F4/80表达；在血清限制和去除丙酮酸条件下构建营养应激模型；采用抗CD3联合IgG2a进行体外刺激；以吞噬实验评估功能；通过qPCR定量CD3、IRF1、Mafb、GATA3、CCL5和HIF1α转录水平；通过Western blot检测NFAT-1、p-c-Jun、IKK、NF-κB和STAT-1蛋白；并用基于微球的多因子检测分析细胞因子分泌谱。

以下为论文结果部分的分节解读。

3.1 RAW cells express T-cell-associated receptors, and the CD3 expression is influenced by time and nutrient deficiency
研究人员首先利用流式细胞术确认RAW细胞确实表达T细胞相关受体。结果显示，RAW细胞中约51%为CD3⁺，约32%为TCR⁺，另有一定比例表达CD4，而CD8与CD28表达极低。这一结果证明RAW细胞具有混合型免疫表型。随后，通过不同培养时间点检测发现，CD3蛋白水平变化不大，但其转录水平在72 h明显高于24 h和48 h，提示CD3表达受时间动态调控。进一步将RAW细胞置于低血清或丙酮酸剥夺条件下，发现CD3在蛋白和mRNA两个层面均显著升高，其中低血清效应尤为明显。与此同时，细胞活率维持在90%以上，且TNF、CCL5和HIF1α等应激/促炎相关指标并未降低，说明营养剥夺并非单纯导致细胞衰亡，而是促使RAW细胞进入一种维持活性且偏促炎的应激状态。该部分结果支持营养剥夺是诱导CD3上调的重要环境因素。

3.2 CD3⁺ RAW cells exhibit efficient phagocytic capacity
为明确CD3⁺ RAW细胞是否仍保留巨噬细胞核心功能，研究人员采用乳胶微球吞噬实验并结合流式细胞术进行分析。结果显示，绝大多数RAW细胞均可吞噬微球，总体吞噬阳性率约96%。进一步比较不同亚群发现，CD3⁺与CD3^-细胞均具有良好吞噬能力，其中CD3⁺吞噬阳性细胞比例较高。该结果表明，表达CD3并未削弱RAW细胞的吞噬功能，提示这类细胞虽然具有非经典表型，但仍保持髓系细胞的重要先天免疫特征。

3.3 RAW cells deliver a proinflammatory profile mediated by CD3 and FcγR signaling
在确认CD3⁺ RAW细胞具备基本功能后，研究人员进一步检测抗CD3联合IgG2a刺激后细胞因子分泌谱，以评估CD3/FcγR相关激活是否引导特定免疫效应。结果显示，该刺激在5 h即可诱导IFN-γ分泌，TNF在5–48 h持续升高，IL-6则在24 h达到显著峰值。相对地，IL-4、IL-5、IL-10等抗炎相关细胞因子以及IL-2均未见明显诱导。由此可见，CD3与FcγR共同刺激在RAW细胞中建立的是偏促炎、而非抗炎或典型T细胞样增殖支持性细胞因子程序。这一部分为CD3⁺ RAW细胞的功能定位提供了直接证据。

3.4 CD3 and FcγR signaling activate the early NFAT pathway and, later, NF-κB in RAW cells
为解析促炎反应背后的信号基础，研究人员检测了CD3经典相关分子在刺激后早期的动态变化。Western blot结果表明，抗CD3加IgG刺激后10 min，NFAT-1显著升高；p-c-Jun在10–20 min维持较高水平；IKKα/β在10 min即被激活，而NF-κB的上调则出现在60 min，提示其活化滞后于NFAT和c-Jun。STAT-1在该体系中未见明显变化。该结果说明，RAW细胞中的CD3相关激活并非完全照搬T细胞模式，而是呈现“早期NFAT/c-Jun、后续NF-κB”的时间序列特征。研究据此认为，RAW细胞可部分模拟TCR/CD3样信号级联，但其炎症输出仍体现巨噬细胞特异性调控。

3.5 CD3 and FcγR signaling activate the IRF-1 transcription factor and suppress MAFB in RAW cells
在转录调控层面，研究人员重点评估了与巨噬细胞炎症极化相关的转录因子。结果显示，抗CD3联合IgG2a刺激后5 h，促炎转录因子IRF-1显著升高，但在24 h和48 h后回归基线；与之相对，具有抗炎或组织驻留相关意义的MAFB在5 h和24 h均被抑制，48 h后恢复。GATA-3并未出现早期抑制，而是在48 h升高。综合来看，CD3相关刺激在RAW细胞内迅速形成“IRF-1上调、MAFB下调”的早期促炎转录程序，这与前述细胞因子及信号蛋白变化相一致，从而进一步支持CD3依赖性促炎表型的建立。

在讨论部分，作者强调RAW 264.7细胞不仅是经典先天免疫研究工具，也可作为探索非经典CD3/TCR样髓系细胞的有用模型。研究提示，RAW细胞具有明显免疫表型可塑性，既表达髓系标志，又可表达CD3、TCR和CD4等淋巴系相关分子。营养剥夺可上调CD3，并维持促炎能力，这表明代谢压力可能是促进CD3⁺巨噬细胞形成的重要微环境线索。与此同时，作者也指出，当前刺激体系中FcγR本身是强效巨噬细胞激活通路，因此观察到的效应不能完全归因于CD3单独作用，更可能反映CD3与FcγR-II/III之间的协同或串扰。该研究的另一个重要认识是，RAW细胞中的CD3相关信号涉及NFAT、c-Jun、IKK、NF-κB及IRF-1等分子，提示其并非偶然表达，而可能确实参与炎症程序调控。不过，作者同样明确指出，尚缺乏CD3敲低或失功能实验，因而还不能建立严格因果关系；此外，抗原呈递、活性氧（ROS）生成、代谢重编程等功能后果仍待进一步研究。

研究结论可译述为：研究结果表明，RAW细胞表达多种传统上与T细胞相关的分子，包括CD3、TCR、CD4和CD8，并在CD3受体被激活后产生功能性应答。经抗CD3刺激后，CD3⁺ RAW细胞表现出吞噬活性以及快速的促炎性细胞因子反应，并伴随包括NFAT、C-Jun和IKK在内的信号通路早期激活，以及NF-κB的延迟激活。营养应激条件下CD3表达的变化提示其受到环境因素动态调控。总体而言，这些结果强调了RAW细胞作为研究巨噬细胞中非经典CD3/TCR信号转导模型的应用价值，并突出了该通路在调控先天免疫应答中的重要性。