《Frontiers in Immunology》：Macrophage polarization state influences fusion and phenotype of human foreign body giant cells in vitro
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摘要引言：巨噬细胞及其融合后的对应物——异物巨细胞（foreign body giant cells, FBGCs），对植入生物材料的长期功能具有决定性影响，协调生物材料吸收和纤维包裹。将巨噬细胞表型调节为有利的极化状态是试图引导异物反应的广泛采用策略。然而，
摘要引言：巨噬细胞及其融合后的对应物——异物巨细胞（foreign body giant cells, FBGCs），对植入生物材料的长期功能具有决定性影响，协调生物材料吸收和纤维包裹。将巨噬细胞表型调节为有利的极化状态是试图引导异物反应的广泛采用策略。然而，巨噬细胞表型与FBGC形成和功能之间的联系尚不清楚。本研究旨在确定明确极化状态的巨噬细胞的融合潜力，并探讨先前极化状态是否转化为原代人巨噬细胞中的FBGC表型。方法：研究人员首先将外周血来源的人巨噬细胞刺激为M0/M1/M2a/M2c极化状态，然后使用白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）刺激其融合为FBGCs。融合后，再次刺激这些细胞以研究各自细胞因子混合物对FBGC表型的影响。结果：结果表明，与未刺激的M2a和M2c巨噬细胞相比，M1巨噬细胞具有更高的IL-4受体表达、改变的细胞骨架，以及显著升高的融合相关基因表达。FBGCs可从所有极化状态形成。尽管M1极化导致融合百分比降低，但形成的FBGCs在细胞大小和细胞核数量方面更大。FBGCs通过形成环绕细胞周边的肌动蛋白环显示出细胞骨架结构的显著变化，这在不同的巨噬细胞极化中一致。与巨噬细胞极化状态相关的选定基因和蛋白的表达要么在融合过程中得以维持，要么在FBGCs重新暴露于极化因子后重新获得。讨论：这些结果为FBGC极化状态的存在提供了证据，强调了巨噬细胞群体和微环境在调节FBGC形成中的重要性。这表明FBGC功能可能是可调控的，例如通过生物材料设计参数，以改善生物材料的长期功能和整合。
**论文解读**
**研究背景与问题**
植入生物材料后的宿主反应，尤其是异物反应（foreign body response, FBR），是决定植入物长期功能的关键因素。巨噬细胞及其融合后的多核巨细胞——异物巨细胞（foreign body giant cells, FBGCs）在此过程中扮演核心角色，它们协调生物材料的降解与纤维包囊。目前，通过调控巨噬细胞极化状态（如M1促炎型、M2a抗炎型、M2c调节型）来引导有利的FBR已成为广泛采用的策略。然而，关于不同极化状态如何影响巨噬细胞融合形成FBGCs的能力，以及融合前的极化状态是否决定FBGCs的功能表型，目前尚不清楚。现有研究主要集中于单核巨噬细胞，对FBGCs的异质性和可塑性知之甚少。因此，开展这项研究的目的是明确原代人巨噬细胞不同极化状态（M0、M1、M2a、M2c）的融合潜力，并探究先前极化状态是否转化为FBGCs的表型特征。
**研究内容与结论**
研究人员通过体外培养原代人巨噬细胞，首先诱导其极化为M0、M1（LPS/IFN-γ）、M2a（IL-4/IL-13）和M2c（IL-10）四种状态，随后使用IL-4刺激融合形成FBGCs，并在融合后再次给予极化刺激观察FBGCs的表型变化。主要结论包括：（1）所有极化状态的巨噬细胞均能形成FBGCs，但M1极化导致融合百分比显著降低，然而形成的FBGCs细胞更大、细胞核数量更多；（2）FBGCs在融合后能够重新获得与先前极化状态相关的基因表达和细胞因子分泌，尤其是M1极化来源的FBGCs在重新刺激后促炎特征显著；（3）FBGCs表现出与单核巨噬细胞类似的表型可塑性，提示存在FBGC极化状态。这些发现表明，FBGC功能可能通过生物材料设计等参数进行调控，从而改善植入物的长期整合与功能。该论文发表在《Frontiers in Immunology》。
**主要技术方法**
研究人员采用两种体外融合方案：方案A使用磁珠分选（MACS）从新鲜血沉棕黄层中分离CD14
+单核细胞，在MEMα培养基中分化为巨噬细胞；方案B使用RPMI-1640培养基培养人外周血单核细胞（hPBMCs）以减少自发融合，并将6-9个供者的巨噬细胞混合以降低个体差异。所有极化诱导均使用特定细胞因子混合物（LPS/IFN-γ为M1，IL-4/IL-13为M2a，IL-10为M2c），融合诱导使用IL-4。关键检测方法包括：免疫荧光染色（F-actin、微管蛋白、波形蛋白等）观察细胞骨架与融合形态；流式细胞术检测极化标志物（CD80、CD206）及IL-4/IL-13受体复合物表达；RT-qPCR分析融合相关基因表达；LEGENDplex?多重免疫分析检测细胞因子/趋化因子分泌；MDA和DCFDA法检测活性氧（ROS）水平。样本来源为荷兰Sanquin血库的健康匿名捐赠者。
**研究结果**
**3.1 异物巨细胞显示独特的细胞骨架组织**
通过免疫荧光染色，研究人员发现M1巨噬细胞呈现更间充质样、细长形态，而M2a和M2c巨噬细胞保持圆形阿米巴样形态。M1巨噬细胞的肌动蛋白足体（podosome）分布与M2a/M2c不同，呈现许多小的肌动蛋白富集斑块位于细胞边缘。在融合过程中，FBGCs形成独特的细胞骨架结构：肌动蛋白在细胞边缘形成环状，微管紧绕细胞核并延伸至细胞末端，中间丝也在细胞中心向末端延伸，且FBGCs表面常残留少量单核细胞。
**3.2 初步数据：M1巨噬细胞自发融合低于M2a/M2c**
在方案A中，极化后（第0天）即观察到自发融合（13-40%），其中M2a巨噬细胞融合率最高（约40%），M1最低（约13%）。IL-4刺激7天后，所有极化状态融合率均增加，但M2a/M2c达到约75%，M1仅约38%，且M2a来源的FBGCs细胞核数显著多于M1。这些差异在IL-4刺激前已存在，提示自发融合（由细胞-细胞接触诱导）对结果有显著干扰，且不同供者间差异大。
**3.3 M1巨噬细胞融合百分比最低，但形成的FBGCs最大**
采用改良方案B（使用RPMI-1640抑制自发融合，并混合供者）后，极化状态确认显示M1巨噬细胞CD80表达显著升高，M2a/M2c巨噬细胞CD206表达升高。M1巨噬细胞IL-4/IL-13受体复合物（IL-4Rα、共同γ链、IL-13Rα1）表达高于M2a，但M2c表达最高。基因表达分析显示，M1巨噬细胞显著上调融合相关基因（CD44、SIRPα、P2RX7）以及促炎标志物（IL-6、CCR7、TNF-α）和NOX2。蛋白水平上，M1分泌MCP-1、IL-1β、IL-6、TNF-α显著升高。融合后，M1巨噬细胞融合百分比仍显著低于M2a（第5天：M1约51% vs M2a约69%），但M1来源的FBGCs中位细胞大小和细胞核数最高（如图8G、H）。此外，M1来源的FBGCs在融合后细胞核面积增加。
**3.4 异物巨细胞在重新极化后保留极化相关基因**
第5天（融合后）基因表达分析显示，M1来源的FBGCs中M1相关基因（IL-6、CCR7、TNF-α）表达降至检测不到，表明融合导致表型转换。重新极化（第7天）后，M1 FBGCs再次上调促炎基因和细胞因子（TNF-α、IL-6、MCP-1），而M2a/M2c FBGCs中IL-10表达有上调趋势。在ROS和酶相关基因方面，M1 FBGCs在融合后NOX2和LIPA表达有升高趋势，但NFκB和MMP9降低。融合相关基因在M1 FBGCs中重新刺激后恢复表达模式。蛋白水平上，M1 FBGCs重新极化后IL-6、TNF-α、TGF-β1和MCP-1分泌显著高于其他组，且ROS检测（MDA和DCFDA）显示重新极化后所有FBGCs ROS水平升高，但M1来源的FBGCs ROS最低。
**讨论与结论**
本研究表明，FBGCs可从所有巨噬细胞极化状态形成，但M1极化导致融合百分比降低，却形成更大的FBGCs。这一现象与初始假设（M1为主要驱动者）相反，可能与M1巨噬细胞代谢依赖糖酵解而非氧化磷酸化、细胞骨架差异以及细胞密度降低有关。M1巨噬细胞虽高表达IL-4受体和融合相关基因，但融合效率低，可能因IL-4受体内化或代谢能量不足。此外，研究还发现FBGCs在重新暴露于极化刺激后能够重新获得与先前极化状态相关的基因和蛋白表达，尤其是M1促炎特征，提示FBGCs具有与单核巨噬细胞类似的表型可塑性，并保留部分“记忆”。这为FBGC极化状态的存在提供了证据，表明可通过生物材料设计参数（如表面化学、拓扑结构、免疫调节因子释放）来调控FBGC功能，从而改善植入物的长期整合与功能。研究结论指出：FBGCs可源自不同极化状态的巨噬细胞，M1极化导致更少但更大的FBGCs；FBGCs在融合过程中维持或重新获得极化相关表型，表明其功能可能像单核巨噬细胞一样可被调控。后续研究需在更接近生理微环境的体外模型中验证这些结果。
