HSP70介导的P-glycoprotein（P-gp）SUMOylation调控抑制铁死亡驱动非小细胞肺癌热抵抗

《Frontiers in Immunology》：HSP70-mediated regulation of P-glycoprotein SUMOylation suppresses ferroptosis to drive thermoresistance in non-small cell lung cancer

　　

目的：热疗是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的一种潜在疗法；然而，细胞对热疗的抵抗仍然具有挑战性。本研究探讨了热休克蛋白70（heat shock protein 70, HSP70）在调节P-glycoprotein（P-gp）的小泛素样修饰（small ubiquitin-like modifier modification, SUMOylation）对非小细胞肺癌细胞热抵抗中的作用。方法：研究人员将人非小细胞肺癌细胞（A549）暴露于热疗，并进行HSP70过表达/敲低、P-gp沉默或Erastin/Ferrostatin-1处理。裸鼠在接受热疗前接种感染过表达HSP70的腺病毒载体（Ad-HSP70）的A549细胞。研究人员选择维拉帕米作为体内P-gp抑制剂。研究人员进行了一系列实验以分析细胞和分子变化，包括活力、迁移、侵袭、铁死亡相关指标及线粒体功能障碍。研究人员使用免疫共沉淀和放线菌酮（cycloheximide, CHX）试验检测HSP70-P-gp相互作用、SUMOylation及蛋白质稳定性。结果：HSP70过表达加速了A549细胞的恶性表型，同时限制铁死亡，从而驱动热抵抗。此外，激活铁死亡部分消除了HSP70过表达的这些效应，而抑制铁死亡部分抵消了HSP70敲低对A549细胞热抵抗的抑制作用。HSP70与P-gp相互作用以调节其SUMOylation，从而增加P-gp蛋白的稳定性和水平。P-gp敲低部分阻断了HSP70的效应并恢复了A549细胞对热疗的敏感性。HSP70通过上调P-gp抑制氧化应激和线粒体功能障碍。在体内，HSP70介导的P-gp SUMOylation抑制铁死亡，促进肿瘤生长和热抵抗。结论：HSP70通过P-gp的SUMOylation抑制氧化应激和线粒体功能障碍，从而抑制铁死亡并促进A549非小细胞肺癌细胞的热抵抗。

研究背景与意义

肺癌（lung cancer, LC）是全球重大的健康问题，其中最常见的类型是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）。热疗作为一种可行的治疗策略，利用癌细胞的热敏感性增强化疗或放疗疗效，同时减少对周围健康组织的损伤。然而，热疗面临的主要挑战是难以彻底根除肿瘤，残留肿瘤易适应热处理而复发生长，即产生热抵抗。目前，阐明NSCLC热耐受的分子机制以克服抵抗至关重要。铁死亡（ferroptosis）是一种不同于凋亡和坏死的程序性细胞死亡，特征为铁依赖、脂质过氧化、活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累和线粒体功能障碍，靶向铁死亡是抑制NSCLC进展的新途径，但其在NSCLC热耐受中的调控机制尚不清楚。热休克蛋白（heat shock proteins, HSPs）是维持蛋白质折叠和稳态的分子伴侣，其中HSP70在热应激下升高。P-glycoprotein（P-gp）是ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白，近期数据显示其赋予肿瘤细胞对小分子铁死亡诱导剂的抵抗。研究人员此前预测P-gp存在多个SUMOylation位点，假设HSP70可能通过SUMOylation稳定P-gp抑制铁死亡从而促进NSCLC热耐受。该研究旨在阐明此机制，为克服热抵抗提供新靶点。论文发表于《Frontiers in Immunology》。

主要关键技术方法

研究人员采用人NSCLC细胞系A549进行体外实验，通过质粒转染实现HSP70过表达（oe-HSP70）与敲低（si-HSP70）及P-gp沉默（si-P-gp），并使用Erastin和Ferrostatin-1调控铁死亡，施以40-42°C热疗。体内实验采用BALB/c裸鼠皮下成瘤模型，接种Ad-HSP70感染的A549细胞并给予全身热疗及P-gp抑制剂维拉帕米（Verapamil）。关键技术包括细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）、Transwell、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）检测表型；免疫印迹（western blot, WB）、实时荧光定量聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）检测分子表达；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）验证蛋白互作与SUMOylation；放线菌酮（cycloheximide, CHX）追踪蛋白稳定性；JC-1探针测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）；Seahorse XF24检测氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）；以及检测Fe²⁺、谷胱甘肽（glutathione, GSH）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、ROS水平，辅以免疫荧光、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling, TUNEL）染色。

研究结果

Elevated HSP70 expression inhibits ferroptosis to promote thermotolerance of NSCLC cells

研究人员发现热疗抑制A549细胞活力、迁移侵袭并驱动铁死亡（脂质过氧化增加，Fe²⁺和MDA升高，GSH、GPX4、SLC7A11降低），同时上调HSP70。HSP70过表达增强细胞活力与侵袭迁移，减少铁死亡指标，促进热抵抗；HSP70敲低则进一步促进热疗诱导的铁死亡并增强抗肿瘤效应。

Activation of ferroptosis partially reverses the promotion effect of HSP70 on the thermoresistance of NSCLC cells

研究人员在HSP70过表达细胞中用Erastin激活铁死亡，部分抵消了HSP70介导的热抵抗（细胞死亡增加，GPX4/SLC7A11下调，表型受抑）；在HSP70敲低细胞中用Ferrostatin-1抑制铁死亡，部分逆转了其对热敏感性的增强。证实铁死亡是HSP70调控热耐受的核心下游机制。

HSP70 enhances P-gp protein stability by regulating SUMOylation of P-gp

研究人员证实热疗及HSP70上调P-gp表达。GPS-SUMO预测P-gp含SUMOylation位点（K374, K410, K413），Co-IP验证HSP70与P-gp互作且P-gp发生SUMOylation，突变体（MUT3）SUMOylation显著降低。CHX试验显示HSP70通过SUMOylation减少P-gp降解，增强其蛋白稳定性。

P-gp knockdown promotes ferroptosis, thus partially reversing HSP70-induced thermoresistance in NSCLC cells

研究人员共转染oe-HSP70与si-P-gp，发现P-gp敲低有效消除HSP70过表达对铁死亡的抑制，恢复铁死亡反应（LDH、脂质过氧化、Fe²⁺、MDA升高，GSH、GPX4、SLC7A11降低），并减弱细胞活力与侵袭迁移，表明P-gp是HSP70介导热抵抗的关键下游分子。

HSP70 inhibits oxidative stress and mitochondrial dysfunction by up-regulating P-gp protein levels

研究人员发现热疗引起ROS升高、SOD降低及MMP、mtDNA、基础呼吸、ATP合成、最大呼吸下降。HSP70过表达抑制上述氧化应激与线粒体功能障碍，敲低则加剧；而P-gp敲低部分废除了HSP70过表达的抑制作用，证明HSP70通过上调P-gp抑制氧化应激与线粒体功能障碍。

HSP70 mediates P-gp SUMO modification, thereby inhibiting ferroptosis to promote thermoresistance and in vivo growth of NSCLC

体内实验中，热疗抑制裸鼠肿瘤生长并诱导铁死亡，同时上调HSP70、P-gp、SUMO1、SUMO2/3。接种Ad-HSP70细胞则减轻铁死亡、增加肿瘤重量、上调相关蛋白。联合维拉帕米抑制P-gp后，逆转HSP70过表达导致的热抵抗，恢复铁死亡与抗肿瘤效应，证实体内HSP70介导P-gp SUMOylation抑制铁死亡促热抵抗与生长。

讨论与结论总结

讨论部分指出，HSP70作为热保护蛋白通过抑制凋亡赋予癌耐热性，但其在NSCLC中经铁死亡调控热耐受的机制未知。本研究显示HSP70通过调控P-gp的SUMOylation抑制铁死亡促热抵抗。P-gp是ABC转运蛋白与耐药相关，研究发现HSP70与P-gp互作并通过SUMO1/2/3增强其稳定性。P-gp敲低消除HSP70抗铁死亡效应并伴随线粒体功能改变。体内证实HSP70上调促生长与热抵抗，维拉帕米可逆转。此研究首次揭示P-gp是HSP70介导SUMOylation的直接靶点，区别于既往HIF-1α研究，完善了HSP70在不同肿瘤应激阶段的调控模式，为热疗联合免疫治疗提供理论支持。局限在于单一细胞系，后续需多细胞系验证及明确精确SUMOylation位点。

结论翻译：HSP70通过P-gp的SUMOylation抑制氧化应激和线粒体功能障碍，从而抑制铁死亡并促进A549非小细胞肺癌细胞的热抵抗。

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