综述：非抗凝肝素：聚糖介导的免疫调节与治疗应用

《Frontiers in Immunology》：Non-anticoagulant heparins: glycan-mediated immune modulation and therapeutic applications

　　

非抗凝肝素(NAHs)是肝素的修饰衍生物，保留了母体化合物的许多生物活性，同时表现出减弱或缺失的抗凝血效应。这些修饰已解锁了多种疾病中的新治疗潜力，包括炎症性疾病、癌症、脓毒症和病毒感染。本综述探讨了NAHs的化学修饰、作用机制、结构-活性关系及治疗应用。NAHs通过与肝素酶(heparanase)、P-选择素(P-selectin)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)等关键蛋白的相互作用，发挥抗炎、抗癌、抗病毒和血管保护作用。此外，它们在药物递送系统（如水凝胶和纳米颗粒）中的应用增强了局部治疗功效。临床前和临床研究的有希望结果将NAHs定位为一类具有多样化治疗应用的有价值药物，尤其在肿瘤学、传染病和重症监护领域。

论文主体部分总结如下：

**1 引言**
肝素作为一种糖胺聚糖(GAG)，自1916年从犬肝中分离以来，其抗凝血活性使其成为血栓预防和栓塞治疗的关键药物。肝素结构由重复的糖醛酸（艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸）和葡萄糖胺二糖单元组成，这些单元在多个位置（N-、2-O-和6-O-硫酸化）发生可变硫酸化，赋予分子密集负电荷和对多种蛋白质的高亲和力。肝素的抗凝血特性主要依赖于其与抗凝血酶III(AT-III)的结合，通过独特的五糖序列（AT-III结合位点）触发构象重排，显著增强对凝血酶（因子IIa）和因子Xa的抑制。近年来发现肝素还具有非抗凝血效应，如抗炎、抗癌、抗病毒和血管保护作用。本综述系统检查了NAHs的制备、生物活性和作用机制，特别强调定量结构-活性关系(SAR)，将化学修饰与选择性靶标识别联系起来，并提出一个统一框架，将化学SAR与免疫调节的分子机制相结合，涉及共享靶标如肝素酶(heparanase)、P-选择素(P-selectin)和HMGB1。

**2 非抗凝肝素的制备**
**2.1 化学修饰技术**：NAHs的制备涉及特定化学修饰以消除抗凝血活性，同时保留其他治疗益处。关键策略包括：高碘酸氧化（选择性裂解未硫酸化糖醛酸的C2-C3键，破坏AT-III结合位点）、N-去硫酸化（去除葡萄糖胺的N-硫酸基团，随后可能进行N-乙酰化）和乙二醇裂解（高碘酸氧化后还原，形成开环双醛残基，随后用酸裂解生成低分子量NAHs）。亚硝酸解聚法（如制备低分子量肝素LMWHs）本身不能产生真正的NAHs，因为其保留了AT-III结合位点，需要额外修饰来破坏该位点。
**2.2 非抗凝肝素的结构表征**：NAHs与肝素的关键区别在于抗凝血活性。先进表征技术如高效液相色谱(HPLC)和核磁共振(NMR)光谱用于确认结构变化，例如通过NMR分析硫酸化模式，以及HPLC-MS分析含3-O-硫酸基的四糖（AT-III结合位点变体）。肝素来源（猪肠黏膜、牛肺或牛肠）的差异导致分子量分布、硫酸化模式和抗凝血活性的变化，对NAH制备的批次一致性有影响。

**3 非抗凝肝素的生物活性**
**3.1 抗炎特性**：NAHs通过抑制白细胞与内皮细胞粘附（结合P-选择素、抑制肝素酶活性）来调节炎症。它们还抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，并抑制HMGB1的激活，从而减轻脓毒症和自身免疫疾病中的炎症反应。此外，NAHs可能干扰补体激活（结合C1q和C3），结合趋化因子如CXCL8(IL-8)和CCL2(MCP-1)破坏趋化梯度，并通过调节NF-κB信号通路减少促炎基因转录。
**3.2 抗癌效应**：NAHs通过靶向肿瘤进展的多个通路发挥抗癌作用。它们抑制肝素酶（降解细胞外基质(ECM)中的硫酸乙酰肝素链）从而减少肿瘤细胞迁移和侵袭。同时，通过阻断血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等信号分子，抑制血管生成。此外，N-去硫酸化并重新乙酰化的肝素衍生物可促进肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)从M2样向M1样极化转变（通过STAT6通路），调节免疫抑制性肿瘤微环境。NAHs还能中和损伤相关分子模式(DAMPs)如细胞外组蛋白，减轻炎症。早期研究显示乙二醇裂解肝素衍生物在癌症模型中减少肿瘤生长和转移，但临床转化面临挑战，多数III期试验未能显示生存获益。
**3.3 抗病毒活性**：肝素衍生物（包括某些NAHs）通过结合病毒表面糖蛋白（如SARS-CoV-2刺突蛋白）阻断病毒进入宿主细胞，这独立于AT-III结合。NAHs还抑制肝素酶活性（减少病毒释放和细胞间传播），并中和促炎细胞因子和DAMPs如HMGB1，减轻“细胞因子风暴”。此外，NAHs保留的微弱抗凝血活性可能有助于预防病毒相关的血栓并发症（如COVID-19中的肺微血栓）。NAHs与多种细胞因子（如IL-6、CXCL8）结合，中和其活性，从而减轻全身性炎症反应。
**3.4 血管保护**：NAHs通过增强内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性，增加一氧化氮(NO)产生，从而改善血管功能并降低血管功能障碍风险（如动脉粥样硬化和高血压）。在缺血再灌注损伤(IRI)和感染性休克中，NAHs帮助恢复正常的血管通透性和血流，防止进一步组织损伤并促进恢复。

**4 非抗凝肝素的作用机制**
**4.1 分子相互作用**：NAHs通过与肝素结合蛋白的相互作用发挥治疗效应。
**4.1.1 肝素酶抑制**：NAHs如乙二醇裂解的N-乙酰化肝素衍生物（roneparstat）对肝素酶具有纳摩尔级IC₅₀（约3 nM），抑制ECM降解，从而阻断肿瘤细胞侵袭和转移。肝素酶活性也与炎症反应相关，NAHs通过抑制肝素酶减少缓激肽产生和局部炎症。
**4.1.2 选择素和整合素拮抗**：NAHs结合并拮抗P-选择素，破坏白细胞-内皮细胞相互作用，限制免疫细胞浸润。在癌症中，阻断P-选择素依赖的粘附减少肿瘤细胞-血小板聚集体形成，降低转移潜力。此外，整合素VLA-4(α₄β₁)被鉴定为肝素的直接结合靶点（解离常数低微摩尔级），而合成五糖fondaparinux无此活性，表明整合素拮抗作用与抗凝血活性可分离。这扩展了NAHs调节免疫细胞和肿瘤细胞粘附的机制。
**4.1.3 HMGB1调节**：NAHs与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)相互作用，HMGB1是一种在细胞应激时释放的核蛋白，作为危险信号激活免疫系统。NAHs抑制HMGB1释放及其与Toll样受体(TLRs)的相互作用，减少过度炎症反应（如脓毒症、类风湿关节炎）。
**4.1.4 与趋化因子相互作用**：NAHs与趋化因子如CXCL12结合，竞争性阻断其与CXCR4受体的相互作用，从而抑制肿瘤细胞迁移和转移。这种干扰破坏了趋化因子-糖胺聚糖介导的免疫细胞迁移。
**4.1.5 组蛋白和其他DAMPs的中和**：NAHs直接结合组蛋白，减轻组蛋白诱导的炎症、内皮损伤和血栓形成，这是脓毒症多器官功能障碍的贡献因素。
**4.1.6 与病毒蛋白相互作用**：肝素与SARS-CoV-2刺突蛋白结合，亲和力高（K_d ~40–70 pM），竞争性阻断病毒与宿主细胞硫酸乙酰肝素(HS)或ACE2受体的结合。NAHs由于结构相似性可能保留部分结合活性，但需要实验验证。
**4.1.6 NPP1和腺苷能轴**：肝素及其衍生物（包括某些NAH化学型）是核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(NPP1, CD203a)的强效选择性变构抑制剂，IC₅₀范围为0.5–73 μM，取决于硫酸化模式。NPP1抑制与抗凝血活性可分离，为NAHs在癌症免疫治疗中调节腺苷能轴提供了新方向。
**4.2 关键通路的抑制**
**4.2.1 炎症性疾病**：NAHs通过干扰HMGB1与脂多糖(LPS)的相互作用，阻断caspase-11（人类中为caspase-4/5）的激活，从而抑制非经典炎症小体通路。这减少了细胞因子释放、保护内皮完整性并改善脓毒症中的器官灌注。
**4.2.2 癌症转移**：NAHs通过拮抗VEGF和bFGF抑制血管生成，并通过抑制VEGF-C/VEGFR-3轴遏制淋巴管生成。此外，它们破坏血小板-肿瘤细胞相互作用，干扰TGF-β1、整合素和CXCL12-CXCR4信号轴，减少转移性播散。
**4.2.3 病毒感染和免疫调节**：肝素通过模拟HS阻断病毒附着，诱导刺突蛋白构象变化，抑制肝素酶活性限制病毒传播，并中和促炎细胞因子减轻炎症。在COVID-19中，肝素可降低IL-6水平，并可能通过NF-κB通路抑制发挥抗炎作用。
**4.3 非抗凝肝素的结构-活性关系**：SAR通过将化学修饰与生物学结果联系起来，定义了NAHs的治疗潜力。关键结构参数包括硫酸化模式、分子量和骨架柔性。高度硫酸化且高分子量的衍生物结合亲和力强，而N-乙酰化和乙二醇裂解衍生物抗凝血活性低但保留对肝素酶和选择素的纳摩尔至微摩尔亲和力。例如，选择性2-O和6-O-硫酸化、适度N-乙酰化（<50%）以及乙二醇裂解残基对强效肝素酶抑制至关重要。在抗炎方面，选择性2-O、6-O和部分N-硫酸化对与趋化因子和粘附分子的相互作用关键。N-去硫酸化结合重新N-乙酰化最小化抗凝血效应同时维持抗炎效力。此外，NPP1抑制的SAR显示电荷密度（硫酸化模式）而非链长是主要决定因素。

**5 非抗凝肝素的临床应用**
**5.1 脓毒症和炎症性疾病**：NAHs通过HMGB1调节在脓毒症中发挥保护作用。临床研究显示，辅助肝素治疗降低了伴有弥散性血管内凝血(DIC)的脓毒症患者死亡率，并改善了凝血功能和促炎细胞因子水平。此外，NAHs在肺部疾病（如COPD、哮喘）、肾脏疾病（如糖尿病肾病）和急性胰腺炎中表现出器官保护特性。
**5.2 癌症治疗**：NAHs通过抑制肝素酶、P-/L-选择素和CXCL12-CXCR4轴发挥抗转移和抗血管生成活性。临床前模型显示减少肿瘤负担和转移。然而，III期临床试验（RASTEN、FRAGMATIC、necuparanib、PI-88）未能显示生存获益，部分原因包括患者选择不当、剂量不足（抗凝剂量限制）和机制窗口错失。相比之下，roneparstat在I期临床试验中显示安全性，CX-01获得急性髓系白血病的孤儿药资格。NPP1抑制为NAHs在癌症免疫治疗中提供了新方向。
**5.3 抗病毒应用**：NAHs通过结合病毒表面糖蛋白阻断病毒进入，并调节宿主免疫应答，增强病毒清除。在SARS-CoV-2中，NAHs通过结合刺突蛋白破坏其与ACE2受体的相互作用，可能作为安全的辅助剂用于早期治疗，无出血风险。
**5.4 血管健康与心血管疾病**：NAHs通过增强eNOS活性和NO产生，维持血管张力、抑制血小板聚集。在肿瘤微环境中，NAHs通过竞争性抑制VEGF/FGF信号发挥抗血管生成作用；而在缺血后心脏修复中，通过eNOS激活和NO产生支持生理性血管生成，促进侧支血管形成。

**6 非抗凝肝素的药学应用**
NAHs因其生物相容性和对肝素结合蛋白的高亲和力，被用于药物递送系统。包括：自组装NAH-药物偶联物（如与紫杉醇、阿霉素的共价连接形成纳米颗粒）、水凝胶局部递送（如肝素-泊洛沙姆基质用于生长因子控释）、聚电解质复合物（与鱼精蛋白形成纳米/微粒）、医疗设备表面固定化（如支架涂层）以及靶向递送（配体修饰的纳米颗粒）。然而，面临结构异质性、监管模糊性（缺乏“非抗凝”的明确定义）、给药途径（多数需肠外给药）等挑战。

**7 结论与未来展望**
NAHs已成为通过聚糖介导相互作用调节疾病关键通路的多功能治疗支架。临床转化结果喜忧参半，失败试验强调了更深层挑战：体外效力与临床疗效的脱节、需要生物标志物驱动的患者选择、以及持续存在的出血风险。未来优先方向包括：基于化学的目标选择性优化、生物标志物开发、组合策略（如免疫检查点抑制剂）的系统评估，以及递送创新（吸入或口服制剂）。