埃塞俄比亚皮肤利什曼病病变的空间映射揭示了不同的组织水平免疫程序

《Frontiers in Immunology》：Spatial mapping of Ethiopian cutaneous leishmaniasis lesions reveals distinct tissue level immune programs

　　

摘要：引言：人类皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis, CL）是一种常见但被忽视的热带病，其特征是炎症性病变，这些病变要么局限于受感染的沙蝇叮咬部位，要么扩散到黏膜或皮肤内。与经过充分研究的临床前模型相比，人类组织反应的性质和多样性仍有待全面认识。方法：研究人员开展了一项探索性研究，使用空间转录组学（spatial transcriptomics）对来自5名埃塞俄比亚CL患者的配对病变和正常皮肤穿刺活检样本进行分析（其中2例感染埃塞俄比亚利什曼原虫（L. aethiopica），1例感染热带利什曼原虫（L. tropica），2例物种未确认）。研究人员使用了无参考反卷积（reference-free deconvolution）、形态学引导的区域分析（morphology-guided regional analyses）和基于免疫组织化学的验证（immunohistochemistry-based validation）来表征组织反应。结果与讨论：研究人员识别出了空间上不同的免疫病理组织反应，包括：i) 伴有干扰素刺激角质形成细胞的上皮增生（epithelial hyperplasia with interferon-stimulated keratinocytes），ii) 伴有三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures, TLS）的细胞毒性（cytotoxicity），iii) 伴有促炎反应的肉芽肿性炎症（granulomatous inflammation with proinflammatory response），iv) 伴有M2极化的髓系细胞反应的肉芽肿性炎症（granulomatous inflammation with M2-polarised myeloid cell responses），以及v) 伴有活跃胶原合成的纤维化重塑（fibrotic remodelling with active collagen synthesis）。该病例系列中的每位患者都体现了这些组织反应中的一种，但免疫病理特征并非互斥。这项研究扩展了研究人员对埃塞俄比亚CL免疫病理学的理解，并提供了一个分子和细胞背景，可应用于更大的临床队列，以检验关于宿主和/或寄生虫决定CL疾病多样性的假设。

论文解读文章

皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis, CL）是一种由多种利什曼原虫（Leishmania spp.）感染引起的被忽视的热带病，全球每年新增约100万例病例，其中埃塞俄比亚高地约有2万至5万例，主要影响年轻人和儿童。埃塞俄比亚CL的临床表现多样，从自愈的局限性皮损到慢性毁容性疾病，甚至黏膜和弥散性病变。然而，尽管该病在20世纪30年代已有报道，但组织水平的免疫病理学机制仍认识不足。现有研究多局限于少数分析物或细胞类型，无法全面揭示病变组织的免疫异质性。近期，空间转录组学（spatial transcriptomics）已被用于其他地区的CL研究，但在东非尚未开展类似工作。因此，这项探索性研究旨在通过空间转录组学技术，系统描绘埃塞俄比亚CL患者病变组织的免疫反应景观，以理解疾病异质性的免疫学和/或寄生虫学基础。

研究人员开展了什么研究，得出什么结论，有什么重要意义？研究人员对5名埃塞俄比亚CL患者的配对病变和正常皮肤活检样本进行了空间转录组学分析，结合无参考反卷积（reference-free deconvolution）、形态学引导的区域分析和免疫组织化学验证，识别出了五种不同的组织免疫程序：上皮增生伴干扰素刺激的角质形成细胞、细胞毒性伴三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures, TLS）、促炎性肉芽肿性炎症、M2极化髓系细胞反应的肉芽肿性炎症、以及纤维化重塑伴活跃胶原合成。每位患者分别表现为其中一种主导程序，但免疫病理特征并非互斥。该研究扩展了对埃塞俄比亚CL免疫病理学的理解，为更大规模临床队列中检验宿主和/或寄生虫决定CL疾病多样性的假设提供了分子和细胞框架。论文发表在《Frontiers in Immunology》。

主要关键的技术方法（不超过250字）：本研究采用10x Genomics Visium平台进行空间转录组学分析，对来自埃塞俄比亚贡达尔市5名男性CL患者（2例L. aethiopica感染，1例L. tropica感染，2例未确认物种；年龄中位数21岁）的配对病变和正常皮肤穿刺活检样本进行基因表达谱检测。使用无参考反卷积工具STdeconvolve估计每个Visium斑点（直径55μm）的细胞类型组成，结合形态学引导的区域分析（基于H&E染色和免疫组织化学）对肉芽肿、上皮区域等进行人工注释，并通过多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence）对三级淋巴结构和肉芽肿中的细胞组成进行蛋白水平验证。

研究结果：
1. Distinct transcriptomes in lesional and non-lesional skin of CL patients（CL患者病变与正常皮肤的差异转录组）：通过无监督聚类和差异表达分析，发现病变组织相对于正常皮肤显著上调免疫球蛋白基因（IGHA1, IGHG3, IGHG4, JCHAIN）、细胞外基质重组基因（MMP3, MMP1）和炎症标志物（S100A7, S100A8, CCL5, CXCL9等），而正常皮肤富集结构性和基质基因。基因集富集分析显示病变组织富集干扰素和细胞因子免疫反应、抗原加工呈递、中性粒细胞脱颗粒等通路。无参考反卷积揭示了病变组织中免疫细胞主题比例显著增加，而正常皮肤以基质/上皮主题为主。

2. Inter-patient variation in lesional architecture（病变结构的患者间差异）：对病变组织单独进行亚聚类和反卷积，发现每位患者具有独特的免疫和基质组成。P1富集B/浆细胞、多种T细胞亚群、促炎性巨噬细胞和中性粒细胞；P2以基质主题为主，Th1占免疫主题优势；P3以抗原呈递主题为主；P4以交替激活巨噬细胞和T细胞-树突状细胞混合主题为主；P5显示浆细胞、浆母细胞、细胞毒性单核细胞和炎症性角质形成细胞主题比例最高。

3. Cytotoxic T cell responses and lymphoid neogenesis（细胞毒性T细胞反应和淋巴新生）：P1病变组织高表达细胞毒性效应分子（PRF1, GZMB, GNLY, NKG7）和B细胞/浆细胞相关基因，计算细胞毒性评分显示P1显著高于其他患者。空间映射显示高细胞毒性区域位于真皮乳头层和网状层，富含干扰素应答基因和免疫检查点标志物。反卷积发现这些区域富集细胞毒性单核细胞、细胞毒性T细胞、M1巨噬细胞和中性粒细胞主题。此外，P1存在一个混合主题（organised_immune），其基因特征（CXCL13, CD79A, POU2AF1, BCL6等）和空间分布提示三级淋巴结构（TLS）的存在，免疫荧光证实为CD20⁺ B细胞核心被CD3⁺ T细胞包围的结构。P1的寄生虫载量也最高。

4. Fibrotic remodelling with preserved stromal architecture（纤维化重塑伴基质结构保留）：P2病变组织高表达胶原基因（COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL6A1, COL6A2）、纤维化标志物（PDGFRB）和肌成纤维细胞标志物（ACTA2），纤维化评分最高。空间映射显示纤维化主要位于网状真皮层，与组织学上基质嗜酸性染色一致。在三个真皮区域（乳头层、毛囊周围、网状层）中，网状层具有最低的免疫细胞组成和最高的纤维化评分。反卷积显示P2富集纤维母细胞主题Fib3，其表达细胞外基质重塑基因（ELN, PODN, MFAP4等）和肌成纤维细胞标志物（SFRP2, LRRC15），且Fib3比例与纤维化评分显著正相关（Spearman’s ρ = 0.8）。

5. Granulomatous inflammation with proinflammatory characteristics（促炎特征的肉芽肿性炎症）：P3组织学显示多个离散的肉芽肿，由CD68⁺上皮样巨噬细胞核心和CD8A⁺淋巴细胞袖带组成。空间转录组分析显示肉芽肿区域富集脂质相关/组织适应巨噬细胞（CHIT1, CHI3L1, LIPA, CYP27A1, CD68）、细胞毒性单核细胞、促炎性M1巨噬细胞和效应T细胞主题。差异表达分析显示P3病变组织高表达类别转换免疫球蛋白基因，提示显著的B细胞浸润。

6. Granulomatous inflammation with M2 myeloid cell polarization（M2髓系细胞极化的肉芽肿性炎症）：P4组织学同样显示肉芽肿，但差异表达分析揭示其微环境显著不同，富集溶酶体基因、MHC-II和抗原呈递基因、髓系标志物、脂质代谢基因和细胞外基质重塑因子，而B细胞和浆细胞标志物表达降低。反卷积显示P4富集交替激活巨噬细胞主题（APC_M2Mac, Act_M2Mac, Tissue_repair_M2Mac, Lipid_macs）和混合Th1-DC、Tcm-DC主题。对肉芽肿进行亚聚类，发现四个空间区域：纤维化核心（ECM基因）、浆细胞-细胞毒性区（免疫球蛋白和细胞毒性效应分子）、T细胞-树突状细胞相互作用区（趋化因子和T细胞标志物）和脂质相关巨噬细胞区（泡沫巨噬细胞标志物），表明肉芽肿内部存在功能分区。

7. Pseudo-epitheliomatous hyperplasia with marked immune infiltration and interferon response（假上皮瘤样增生伴显著免疫浸润和干扰素反应）：P5（唯一确认L. tropica感染的病例）病变组织高表达角质形成细胞过度增殖相关基因（KRT6B, KRT14, KRT16）、抗菌防御相关基因（S100A7A/9, SLPI, PI3）和细胞连接蛋白基因。炎症性角质形成细胞主题在所有表皮层中显著富集，炎症性角质形成细胞占总角质形成细胞比例高达0.82。对表皮斑点进行亚聚类，得到六个空间上不同的微环境，分别具有独特的分子特征和预测的细胞组成，体现了复杂的炎症性增生。

总结讨论部分：本研究通过空间转录组学描述了埃塞俄比亚CL病变中五种候选组织水平免疫病理程序。关键发现包括：P1首次报告了CL病变中的三级淋巴结构（TLS），且与高寄生虫载量共存；P2的纤维化程序与最长病变持续时间（26个月）相符；P3和P4均显示肉芽肿性炎症，但周围微环境截然不同（P3促炎性，P4 M2极化）；P5的显著上皮增生与L. tropica感染相关。研究还讨论了细菌超感染可能作为混杂因素，以及样本量小、寄生虫物种鉴定不完全等局限性。研究结论翻译如下：总之，我们的研究为埃塞俄比亚CL患者的免疫病理反应复杂性提供了新见解。通过空间解析肉芽肿性炎症、细胞组成以及基质和上皮重塑程序，我们建立了一个连接描述性组织病理学与分子免疫学的CL发病机制分子框架。这些发现具有假设生成性质，未来需要更大规模的纵向队列研究来确定这些空间程序是否代表稳定的病理类型、反映病变阶段，或受寄生虫物种、宿主因素或两者组合的影响。这些发现最终可能为使用组织生物标志物指导患者分层和针对CL不同组织程序的个性化免疫调节策略提供依据。