血脂异常诱导的脑内线粒体功能障碍在ApoE基因敲除小鼠中未达到病理水平

《Neurochemical Research》：Dyslipidemia-Induced Mitochondrial Dysfunctions in the Brains Does Not Reach Pathological Levels in the ApoE-Knockout Mice

　　

摘要：尽管血脂异常和脂质积累是包括中风和神经退行性疾病在内的多种神经系统疾病的公认风险因素，但血脂异常是直接导致神经元死亡还是作为继发性因素仍存在争议。为回答此问题，与ApoE4突变体相比，ApoE基因敲除是研究血脂异常的更合适模型，因为E4等位基因表现出异构体特异性结构构象，从而产生等位基因特异性效应。在本研究中，研究人员检查了ApoE基因敲除小鼠的神经表型以及线粒体和代谢改变，这些小鼠从幼年开始就表现出血清胆固醇和甘油三酯水平升高。这些突变小鼠表现出轻度认知表型，表明大脑皮层功能受到脂质失调的影响。电子传递链复合物IV（complex IV）活性降低表明1岁龄突变小鼠的线粒体功能受损。皮层组织中氧化应激增加，以及关键抗氧化基因表达下调，表明突变小鼠的氧化应激和线粒体损伤增加。还观察到线粒体质量减少，可能是由于线粒体自噬（mitophagy）增加。然而，尽管1岁龄突变小鼠的神经突退化，但未检测到广泛细胞死亡或皮层神经元计数显著减少。Pgc1a基因（线粒体生物发生的主要调控因子）上调，表明大脑中存在保护机制。总体而言，这些发现与Ldlr^-/-突变小鼠表型一起，提示单独的高脂血症可能不足以诱导显著的神经退行性变。应该存在其他因素在这些疾病的发病机制中起关键作用。

以下是对论文主体内容的解读文章：

**研究背景与问题**

脂质约占大脑干重的50%至60%，对神经生理学、结构完整性、能量代谢和信号传导至关重要，同时参与髓鞘形成、神经绝缘和突触可塑性。脑内脂质代谢受损会诱导脂质积累和脂毒性代谢产物产生，可能触发中枢神经系统疾病和损伤。临床研究已将血脂异常确定为缺血性中风、血管性痴呆和阿尔茨海默病等多种神经系统疾病的主要风险因素，并可能加重多发性硬化等脱髓鞘疾病。血脂异常可能通过慢性神经炎症、氧化应激、血脑屏障完整性受损以及毒性蛋白聚集体（如β-淀粉样蛋白和α-突触核蛋白）积累等机制导致神经退行性变。

然而，关于血脂异常直接导致神经退行性变和神经元死亡的观点存在矛盾证据：中年人群高胆固醇水平与痴呆风险增加相关，但部分研究在老年人群中未观察到这种关联，甚至发现保护作用；极低水平低密度脂蛋白胆固醇或总胆固醇与潜在神经毒性和出血性中风或痴呆风险增加相关；他汀类药物对认知功能的影响存在争议；家族性高胆固醇血症个体中痴呆风险未见增加。啮齿动物模型研究也尚无定论：低密度脂蛋白受体敲除（Ldlr^-/-）小鼠表现出认知和行为缺陷，但未观察到大规模神经元死亡导致的脑结构萎缩。ApoE4转基因小鼠（阿尔茨海默病最强遗传风险因素）表现出神经退行性表型，但其等位基因特异性构象可能导致与单纯血脂异常不同的效应。因此，研究人员选择ApoE基因敲除小鼠（ApoE缺失破坏脂质稳态，导致血浆胆固醇和甘油三酯水平升高）作为研究对象，以探究血脂异常对脑功能的独立影响。该研究发表在《Neurochemical Research》。

**主要技术方法**

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）动物模型：从台湾国家应用研究院生物模型中心获取ApoE基因敲除小鼠（C57BL/6-Apoe^em1Narl/Narl）和C57BL/6JNarl对照小鼠，在标准条件下饲养；（2）行为学测试：旷场实验评估运动能力和探索活动，Y迷宫实验评估空间工作记忆和自发交替行为；（3）生化检测：使用干化学分析仪测定血清总胆固醇和甘油三酯水平；通过荧光底物裂解法测定皮层β-分泌酶活性；使用DCFH探针检测脑组织活性氧/活性氮（ROS/RNS）水平；（4）分子生物学分析：通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测线粒体DNA（mtDNA）与核DNA比值，评估线粒体质量；通过RT-qPCR检测基因表达水平，包括线粒体生物发生（Pgc1a、Nrf2）、分裂（Drp1、Fis1）、融合（Mfn2、Opa1）、抗氧化酶（Sod1、Gpx4、Catalase）和凋亡（Bax、Bak）相关基因；（5）组织学分析：免疫荧光染色检测NeuN（成熟神经元标志物）和MAP2（神经突标志物）；（6）酶活性测定：分光光度法检测线粒体电子传递链复合物I-V活性。

**研究结果**

**ApoE基因敲除突变小鼠表现出胆固醇稳态缺陷**：通过代谢表型确认，ApoE基因敲除小鼠从12周龄开始出现早发性高脂血症和高胆固醇血症，血清甘油三酯和胆固醇水平在整个实验期间保持恒定，使得该模型适用于研究不同阶段高胆固醇血症和高脂血症的影响。

**ApoE基因敲除突变小鼠观察到认知缺陷**：旷场实验显示，年轻成年小鼠（3-4月龄）运动能力无改变；老年小鼠（12-14月龄）运动能力均下降，但脂质代谢紊乱未显著影响运动参数。Y迷宫实验中，老年突变小鼠自发交替三联体百分比降低，表明长期高脂血症导致工作记忆和认知功能受损。

**脂质代谢改变未影响分泌酶活性**：皮层β-分泌酶活性在突变小鼠与对照组之间无显著差异，表明ApoE基因功能缺失或长期血脂异常不会导致淀粉样斑块形成，这与ApoE4转基因小鼠的表型不同，提示ApoE4小鼠的阿尔茨海默样表型可能具有等位基因特异性。

**老年基因敲除小鼠脑中未检测到主要神经元死亡**：组织学分析显示，大脑大小和整体解剖结构无差异；NeuN阳性细胞计数显示皮层神经元数量在两组间相似；但MAP2标记强度显著降低，表明神经突在血脂异常条件下退化。促凋亡基因Bax和Bak表达未增加，表明无神经元死亡。这些发现与分泌酶活性分析结果共同提示，长期高胆固醇血症和高脂血症不会导致脑内主要细胞死亡，ApoE4突变小鼠的阿尔茨海默样表型可能是等位基因特异性而非ApoE功能缺失所致。

**基因敲除小鼠脑中电子传递链活性降低**：线粒体电子传递链复合物IV活性在突变小鼠脑中降低15%，表明胆固醇可能整合入线粒体膜并影响其功能。

**老年基因敲除小鼠脑中抗氧化酶功能受损**：DCF荧光检测显示老年突变小鼠皮层中ROS/RNS水平升高，指示氧化应激增加。同时，线粒体抗氧化酶Sod1、Gpx4和Catalase的转录水平均下调，表明高胆固醇血症可抑制线粒体抗氧化系统，从而促进氧化应激。

**基因敲除小鼠中线粒体生物发生发生改变**：mtDNA与核DNA比值降低20%，表明线粒体质量减少。线粒体生物发生关键调控因子Pgc1a和Nrf2基因表达上调，表明线粒体生物发生增强。线粒体分裂相关基因Drp1和Fis1以及融合相关基因Mfn2和Opa1的表达水平在两组间无显著差异，表明高脂血症条件下线粒体分裂与融合平衡未改变。

**讨论与结论**

研究讨论指出，ApoE基因敲除小鼠与ApoE4转基因小鼠的神经表型存在显著差异：ApoE4小鼠表现出分泌酶活性改变、蛋白聚集增加和细胞死亡增强，而ApoE基因敲除小鼠未出现这些特征。与Ldlr^-/-小鼠相比，ApoE基因敲除小鼠同样未观察到蛋白聚集或主要细胞死亡，但Ldlr^-/-小鼠的脑线粒体功能尚未被评估。三种血脂异常小鼠模型的表型比较提示，血脂异常诱导脑内代谢缺陷和线粒体功能障碍，进而触发神经炎症、突触丢失和认知缺陷，但可能因先天神经保护机制而未达到病理水平。

研究人员观察到电子传递链复合物IV活性降低，可能原因包括：线粒体膜损伤（但Bax/Bak未上调不支持此假说），或胆固醇和脂肪酸积累导致膜特性改变从而影响电子传递链活性。氧化应激升高被认为是线粒体功能障碍导致神经退行性变的主要机制；在ApoE基因敲除小鼠中，ROS/RNS水平升高伴随抗氧化酶基因表达下调，而Nrf2表达上调可能是一种保护性反应。线粒体质量减少提示脂质积累可能上调了线粒体自噬。

研究结论部分翻译如下：总结而言，在ApoE基因敲除小鼠中，过度的脂质积累导致氧化磷酸化（OXPHOS）受损、氧化应激增加和线粒体质量减少，这可能通过增加线粒体自噬实现。在ApoE4突变小鼠中，线粒体表型包括融合增加、线粒体自噬紊乱和钙超载，这些仅在ApoE4突变小鼠中检测到的现象导致氧化应激升高。由于氧化应激升高诱导的线粒体改变是神经退行性变中突触变性和细胞死亡的关键因素，这些现象可能是ApoE4小鼠表现严重神经表型的原因。值得注意的是，研究人员观察到线粒体生物发生关键基因Pgc1a和Nrf2表达上调，表明线粒体生物发生增强且维持正常线粒体动力学的机制功能正常。此外，线粒体改变未诱导严重线粒体损伤，BAX/BAK表达未上调，表明这些突变小鼠中观察到的线粒体改变未达到病理水平。尽管ApoE基因敲除小鼠表现出典型的高脂血症表型，但这一表型可能不完全等同于神经退行性疾病患者的临床特征。除高脂血症外，脂质转运过程也受到破坏。血脑屏障缺陷在ApoE基因敲除小鼠中已有报道。本研究中线粒体检测采用整体组织设计，这些线粒体改变是否普遍存在于大多数细胞类型或特定于某些细胞类型，尚需进一步研究。