载塞瑞替尼的富透明质酸脂质纳米胶囊作为肺部靶向治疗的理想载体：配方设计、优化及放射性分布研究

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Ceritinib-Loaded Hyaluronic Acid-Enriched Lipid Nanocapsules as A promising Platform for Lung Targeting: Formulation, Optimization, and Radiodistribution

　　•通过PIT技术优化后的CER负载型HA-LNCs，其粒径为22纳米且稳定性极高。•优化后的配方具有极小的粒径（22纳米）、高稳定性以及更强的溶解能力。•这类球形、稳定的LNCs可实现由Higuchi机制调控的双相药物释放。•与CER分散液相比，CER-LNCs的细胞毒性显著更强。•经放射性标记的CER-LNCs在肿瘤中的摄取量高出约4.13倍，同时Cmax和AUC值也有所上升。

引言
肺癌是全球范围内极为重要的健康问题，因其高发率和高死亡率而备受关注，通常会导致比其他类型癌症更差的预后和更低的生存率[1, 2]。从组织学上来看，肺癌主要分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC约占所有肺癌病例的85%[3, 4]。高死亡率和转移率凸显出迫切需要新型治疗药物及先进的递送策略，以在尽可能减少副作用的同时改善患者的治疗效果[5]。

传统的系统性治疗方法，如化疗和放疗，往往存在诸多局限，包括药物在肿瘤部位的积累不足以及严重的全身性不良反应[6]。药物的全身给药往往导致到达肺部癌细胞的药物浓度较低，同时在健康组织中的高剂量暴露又会引发剂量限制性的毒性反应[7, 8]。这一瓶颈问题凸显出亟需采用靶向治疗和局部递送方法，以优化肺癌的治疗效果[1, 2]。

针对具有特定基因突变的患者，如具有间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排的患者，小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）带来的靶向治疗已经彻底改变了这类疾病的治疗格局[9]。作为第二代ALK抑制剂，CER在治疗ALK阳性的转移性NSCLC方面展现出巨大潜力[9, 10]。尽管疗效显著，但CER在药代动力学和制剂方面仍面临诸多挑战。根据生物制药分类系统（BCS）的分类，CER属于IV类药物，其特点为水溶性低且渗透性差[11, 12]。这种较低的溶解度导致其口服生物利用度仅约为25%，并且在胃肠道内的吸收情况难以预测，从而给其临床应用带来了诸多困难[13, 14]。此外，高水平的系统暴露往往与剂量限制性毒性以及高蛋白结合率相关[13]。

为克服CER的溶解度限制，众多研究致力于探索各种药物制剂创新方案[13]。为提高CER的溶解度和生物利用度，人们采用了多种策略，包括使用增溶剂、脂质制剂、无定形固体分散体以及各种基于纳米粒子的药物递送系统[12]。例如，人们将CER纳入纳米结构脂质载体（NSLCs）[13]、尼奥斯姆囊泡[15]以及自纳米乳化药物递送系统（SNEDDS）[9]中，以此解决其溶解度和渗透性不佳的问题。这些纳米制剂充分体现了先进药物递送系统在提升难溶性药物治疗效果方面的巨大潜力。

由于CER的较差溶解度、剂量限制性毒性以及较低的肿瘤积累能力，其临床疗效受到了极大限制[11]，因此，这种高效ALK抑制剂的成功应用在很大程度上依赖于创新的靶向递送策略。因此，使用专门的纳米载体至关重要，它们能够规避游离药物的种种限制，实现更高的肿瘤积累率以及更长时间的药物在肿瘤部位停留时间，进而最大化治疗浓度并降低全身暴露水平[12]。

CER的治疗效果取决于那些能够克服其生物制药学缺陷的创新递送策略，尤其是较低的溶解度和较差的肿瘤积累能力。在这方面，纳米技术提供了特殊的平台，可通过靶向递送实现药物在肺癌肿瘤中的选择性沉积[16]。这种靶向作用主要通过两种机制实现：被动靶向，即利用肿瘤血管的增强渗透和滞留（EPR）效应实现药物的优先积累[17]；主动靶向，则是通过在纳米载体上添加配体（如透明质酸），使其与癌细胞表面过度表达的受体（如CD44）结合，从而促进药物的选择性细胞摄取[18]。

在各类纳米载体中，脂质纳米胶囊（LNCs）因其独特的结构和简单的制备工艺，已成为极具应用前景的药物递送系统。LNCs是一种混合结构，由亲脂性核心以及由磷脂和聚乙二醇化表面活性剂构成的表面活性层所包围[19, 20]。正是这种独特的核壳结构，使得LNCs与其他脂质纳米载体，如固体脂质纳米颗粒（SLNs）和脂质纳米颗粒（LNPs）有所区别。与SLNs不同，SLNs在室温和体温下均为固体脂质，且由于储存过程中脂质结晶，往往存在药物载量低以及药物被排出体外的问题；而LNCs则拥有液态脂质核心，这大大提升了其对CER这类高亲脂性药物的溶解能力和包封效率[21, 22]。此外，虽然通常用于核酸和疫苗递送的LNPs一般由可离子化的阳离子脂质与辅助脂质及胆固醇共同构成无定形的固液混合基质，但LNCs则是通过一种低能量、无需溶剂的相转变温度（PIT）工艺制备而成的。这种方法能产生高度稳定的纳米结构，其致密的聚乙二醇化表面层还赋予了它们“隐身”特性，这使得它们相比传统脂质系统更能避免被网状内皮系统清除[19]。LNCs的制备通常采用一种简单、可重复的无需溶剂的工艺，该工艺利用油和水在加热处理过程中的相转变原理，无需使用有害的有机溶剂，因而更加安全，也更适合大规模工业化生产[23, 24]。在制备过程中，通常需要在水相中加入氯化钠，这一步骤对于调节相转变温度以及确保形成单分散的纳米级体系至关重要[25, 26]。LNCs的结构具有诸多优势，包括极高的稳定性、可控的药物释放特性、较高的药物载量，以及能够避免被单核吞噬细胞系统快速清除，从而实现更长时间的体内循环[27, 28]。这些优点，再加上其较小的粒径，使得LNCs相比脂质体或纳米乳剂更具优势[25]。

LNCs在靶向癌症治疗领域展现了强大的作用。其聚乙二醇化表面层有助于实现被动积累，而且LNCs还被发现能够暂时抑制P-糖蛋白的功能，从而提高细胞内的药物浓度，这对于克服多药耐药性具有重要意义[29]。以往的研究已成功利用LNCs递送埃托ポ苷等抗癌药物，用于治疗胶质母细胞瘤以及多重耐药肿瘤，这些研究在体内模型中证实了LNCs的抗癌功效[30, 31]。此外，Tsakiris等人还在体内结直肠癌模型中展示了负载有特定成分的LNCs的抗癌效果[29]。再者，LNCs也被视为用于肺部药物递送的极具前景的递送系统[32, 33]。然而，尽管具有这些显著优势，目前尚未有研究探讨将LNCs用于CER的肺部递送。因此，开发一种针对CER的主动靶向LNCs递送平台，特别是通过静脉给药来增强其在肺癌肿瘤中的积累能力，仍是亟待探索的关键领域。

主动靶向策略通过利用癌细胞在受体表达方面的差异，实现了对癌细胞的更高选择性[34]。在此背景下，天然糖胺聚糖——透明质酸（HA），可作为功能化纳米载体的理想配体[35]。透明质酸在细胞外基质（ECM）中含量丰富，且具有优异的生物相容性和生物降解性[36]。尤为重要的是，透明质酸对簇决定因子44（CD44）受体具有很高的亲和力[35, 37]。由于许多肺癌细胞表面，包括极具侵袭性的NSCLC细胞系A-549以及癌症干细胞，都存在CD44受体的过度表达，因此将纳米载体（如LNCs）与透明质酸结合，就能够实现高度选择性的主动靶向[38]。这种透明质酸涂层可通过透明质酸-CD44受体介导的内吞途径，增强癌细胞对药物的摄取[34]。除了作为靶向配体外，透明质酸还常被引入药物递送系统中，以提升纳米载体的胶体稳定性并保持其在水中的分散性，从而间接提升制剂的性能[35]。经过改造的透明质酸纳米载体在体外和体内的癌症治疗研究中均展现出巨大潜力[36, 39, 40]。此外，基于透明质酸的纳米载体也曾被用于NSCLC的化疗研究，证明了它们在克服多药耐药性以及改善治疗效果方面的潜力[41]。例如，就有研究尝试使用经过透明质酸涂层的脂质体来改进肺癌化疗，该研究采用了两阶段的靶向策略，旨在克服多药耐药性问题[42]。还有些研究详细阐述了负载有紫杉醇的经过透明质酸改造的脂质体的制备过程，这类脂质体被用于针对线粒体进行特异性递送，以攻克耐药性肺癌[43]。另外，经过透明质酸改造的载有siRNA的壳聚糖纳米颗粒在NSCLC的靶向基因治疗中也展现出了强大的抗肿瘤效果[44]。因此，用透明质酸修饰LNCs（即负载有CER的富透明质酸LNCs），有望通过实现针对CD44受体的特异性细胞摄取以及提升其物理化学性能，从而最大限度地提高治疗效率。

诊疗一体化纳米平台是一种多功能纳米系统，它能够同时递送成像探针和治疗药物，从而实现精准的疾病定位、实时跟踪、个性化治疗方案的优化，相较于传统治疗手段具有显著优势[45]。除了能够降低全身毒性外，用生物相容性聚合物或靶向基团对表面进行修饰，还能进一步提升肿瘤的特异性以及药物在细胞内的摄取效率[46]。通过实现药物递送与非侵入式成像的同步进行，将诊疗一体化纳米平台与放射性标记技术，尤其是锝-99m（[99mTc]Tc）技术相结合，能够显著提升癌症的诊断和治疗水平[47]。由于其独特的核特性，人们可以实时追踪药物的生物分布、在肿瘤中的积累情况以及清除过程，而不会影响治疗效果[48, 49]。因此，诊疗一体化纳米载体是一种提升抗癌疗法效果、安全性及精准度的有力策略，它在推动下一代癌症纳米医学的发展方面持续发挥着重要作用[50, 51]。

在本研究中，我们尝试制备了负载有CER的富透明质酸LNCs纳米系统。为了系统地优化其制备工艺，以实现最佳的治疗效果，采用稳健的统计方法至关重要。我们运用D最优混合设计，来评估各种配方参数及其相互作用对关键质量属性的影响，这些质量属性包括粒径（PS）、泽塔电位（ZP）、多分散性指数（PDI）以及溶解能力（SC）。确定出最优的CER负载型富透明质酸LNCs配方后，我们还对其进行了系列体外表征研究，包括通过透射电子显微镜（TEM）分析其形态结构，以及评估其药物释放曲线和物理稳定性。此外，我们还测试了该最优配方对肺癌细胞系的体外细胞毒性。最后，为了验证所开发的递送系统的有效性，进行体内生物分布研究显得极为重要。我们将对最优筛选出的LNCs进行[99mTc]Tc放射性标记，然后通过静脉注射的方式将其注入携带肿瘤的动物模型体内。通过比较放射性标记的LNCs与CER分散液在肺部的沉积情况、在组织中的摄取程度以及药代动力学行为，我们可以准确评估其生物分布特征。这一全面的策略旨在揭示富透明质酸LNCs纳米系统作为一种具有潜力的、能够主动靶向肺部的药物递送系统，在肺癌的影像学检查或治疗中的应用价值。据我们所知，这是首项研究将放射性标记的富透明质酸LNCs用于CER在肺癌治疗中的递送。在这一单一的纳米载体平台上，本研究结合了基于核医学的生物分布分析、透明质酸介导的主动靶向作用以及基于统计学的配方优化。除了能够实现CER在体内生物分布的实时追踪外，这种综合方法还为提升CER的药代动力学特性以及实现肿瘤选择性递送提供了一种极具前景的诊疗一体化策略。为了清晰地展示本研究的内容，图1给出了整个研究流程的示意图。

材料部分
塞瑞替尼（CER）是由埃及Chemipharm for Pharmaceutical Industries公司慷慨提供的免费样品。氯化钠和纤维素透析膜则购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。Labrafac? Lipophile WL1349由法国Gattefosse公司提供，而Solutol? HS 15则由德国BASF公司捐赠。Lipoid? S75则购自德国路德维希港的Lipoid GmbH公司。磷酸二氢钾、磷酸氢二钠以及乙醇则由El-Nasr公司提供。

通过D最优混合设计制备负载有CER的富透明质酸LNCs

我们采用相转变温度（PIT）技术来制备负载有CER的LNCs，这是一种低能耗的乳化方法，它利用了非离子型表面活性剂的溶解度随温度变化的特性[19]。这一对温度敏感的反应过程表现为：在较低温度下，混合物为油包水（O/W）型乳液；而在较高温度下，则转变为水包油（W/O）型体系。我们将含有高浓度表面活性剂（Solutol HS-15浓度大于10%）的混合物置于特定温度环境中，即可实现这种相态转换。

结论
总之，本研究通过D最优混合设计，成功开发并筛选出了了一种最优的富透明质酸LNCs，用于提升CER在肺部的递送效果。该最优配方具有极小的粒径（约22纳米）、出色的物理化学稳定性，以及高效的药物包封能力。体内生物分布研究显示，与游离药物分散形式相比，药物的肺部积累量增加了3.2倍，且肺脏与血液中的药物比例也有所改善。知情同意声明：不适用。CRediT作者贡献说明：Mennatullah M Ibrahim：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、监督、软件使用、资源提供、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理、概念构建。Marwa Eid Sayyed：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、监督、软件使用、资源提供、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理、概念构建。Khaled M. Attallah：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写。数据可用性：数据将应要求提供。资金支持：作者未获得任何外部资助。利益冲突声明：作者声明没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。致谢：不适用。Marwa Eid Sayyed|Mennatullah M. Ibrahim|Khaled M. Attallah