一种新型IDO1/NE双靶点抑制剂IMM-H018通过抑制细胞因子风暴和微血栓形成并逆转免疫抑制来预防原发性和继发性脓毒症并改善肾损伤

《Advanced Science》：A Novel IDO1/NE Dual Inhibitor, IMM-H018 Prevents the Primary and Secondary Sepsis and Ameliorates the Kidney Injury Through Inhibiting the Cytokine Storm and Microthrombosis, and Reversing Immunosuppression

　　

脓毒症的特征是同时存在过度炎症、免疫抑制和凝血异常，使得单靶点治疗不足。在本研究中，研究人员探索了一种同时抑制中性粒细胞介导的炎症和逆转免疫功能障碍的策略。在中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抑制剂Sivelestat和吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）抑制剂Epacadostat的联合治疗在脂多糖（LPS）和盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠中显示出优于任一单药治疗的疗效。基于这一概念，研究人员设计并合成了一种新型双靶点IDO1/NE抑制剂IMM-H018。IMM-H018在体内和体外有效抑制了IDO1和NE的活性，并显著提高了CLP诱导的脓毒症小鼠的生存率。在低剂量LPS模型中，IMM-H018减轻了全身炎症，恢复了外周血、胸腺和脾脏中的免疫功能，效果优于联合治疗。此外，IMM-H018通过抑制IDO1-Kyn-AhR-TF通路改善肾灌注并减少微血栓形成，从而减轻了脓毒症相关急性肾损伤。在二次打击脓毒症模型中，IMM-H018预防了继发感染，通过增强吞噬作用提高了细菌清除率，保护了肾脏免受损伤，并延缓了从急性肾损伤向慢性肾功能障碍的进展。这些发现将IMM-H018确定为脓毒症及脓毒症相关肾损伤的一种有前景的治疗候选药物。

**论文解读文章**

**研究背景**
脓毒症（Sepsis）是机体对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，其病理过程涉及过度炎症、免疫抑制和凝血异常三大核心环节，最终引起组织损伤和多器官衰竭，死亡率居高不下。目前临床治疗主要依赖早期抗生素、血流动力学支持和肾脏替代疗法，但针对单一靶点的药物（如抗炎或免疫调节剂）在临床试验中效果不佳，难以应对脓毒症复杂的病理机制。脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）是常见且严重的并发症，其发病机制涉及肾血管功能障碍、微血栓形成及中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的持续积累，导致肾灌注不足和肾小管损伤。近年来，联合治疗策略（如同时抑制炎症和逆转免疫抑制）受到关注，但尚未有成熟的药物问世。中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）在脓毒症中过度激活会加剧炎症和组织损伤，而吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）作为内源性免疫检查点酶，其活性升高促进免疫抑制，两者均与脓毒症和SA-AKI密切相关。现有研究表明，单独抑制NE或IDO1均能部分改善脓毒症，但无法同时解决炎症和免疫抑制两大问题。因此，开发同时靶向NE和IDO1的双重抑制剂具有重要临床意义。

**研究内容与结论**
研究人员首先验证了联合使用NE抑制剂Sivelestat（Siv）和IDO1抑制剂Epacadostat（Epa）在LPS和CLP诱导的脓毒症小鼠中的协同效应，发现联合治疗比单药更能延长生存期，减轻炎症因子风暴，恢复淋巴细胞数量，减少胸腺T细胞凋亡，降低PD-1表达，并显著改善肾损伤（如降低血尿素氮、β2-微球蛋白和NGAL水平，减轻肾小管损伤和微血栓）。基于此，研究人员利用AI辅助设计合成了一系列化合物，最终筛选出具有双重抑制活性的小分子IMM-H018（2-((((4-氯苄基)硫代)羰基)氨基)苯甲酸）。体外酶学实验表明，IMM-H018对IDO1和NE的IC₅₀分别为41.4 nM和0.82 μM，且对IDO1呈非竞争性抑制，对NE呈竞争性抑制，均属可逆性抑制剂；通过紫外可见光谱分析和分子对接，证实IMM-H018与IDO1的Fe³⁺-血红素结合，并与NE的活性位点形成盐桥和疏水作用。在体内实验中，IMM-H018剂量依赖性地降低脓毒症小鼠血清Kyn/Trp比值（反映IDO1活性）和NE活性，显著抑制细胞因子（TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10）释放，增加外周血淋巴细胞和单核细胞数量，减少胸腺T细胞凋亡，降低CD4/CD8比值和PD-1表达，逆转免疫抑制。在CLP致死性模型中，IMM-H018预处理或治疗性给药（4小时后）均显著提高生存率（分别为58.3%和33.3%），优于联合治疗组。在肾脏保护方面，IMM-H018剂量依赖性地降低血清BUN、β2-MG和NGAL水平，减轻肾小管损伤和微血栓形成，通过多光谱光声断层扫描（MSOT）证实其改善肾灌注；mRNA测序和KEGG/GSEA分析显示，IMM-H018下调了血小板活化、HIF信号通路、NETs形成、TNF信号通路及补体与凝血级联等SA-AKI相关通路。进一步机制研究揭示，IMM-H018通过抑制IDO1-Kyn-AhR-TF轴，减少肾组织组织因子（TF）和CYP1A1表达，抑制AhR核转位，从而减少微血栓形成；同时，IMM-H018还通过抑制NE活性减少NETs形成（降低CitH3水平）。在二次打击脓毒症模型中（LPS诱导免疫抑制后3天再感染大肠杆菌），IMM-H018显著降低外周血细菌载量，增强巨噬细胞吞噬功能和抗原呈递（上调MHC II表达，下调CD206+ M2型比例），并减轻炎症、免疫抑制和肾损伤，同时减少纤维连接蛋白沉积，提示可能延缓AKI向慢性肾病（CKD）的转变。药代动力学研究显示，IMM-H018口服生物利用度在小鼠和犬中分别为74.4%和46.7%，在肾脏有较高组织分布（T/P比>10），且在2周重复剂量毒性研究中未观察到明显不良反应，具有良好的安全性。该研究发表于《Advanced Science》。

**主要关键技术方法**
研究人员主要采用以下技术方法：酶活性测定（基于细胞和重组酶的IDO1/NE活性检测）、动物模型（C57BL/6J小鼠的CLP和LPS诱导脓毒症模型、二次打击模型，样本来源北京SPF生物技术有限公司）、流式细胞术（检测淋巴细胞凋亡、PD-1表达、巨噬细胞M1/M2标记及MHC II）、免疫组化和免疫荧光（检测肾组织NGAL、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、CitH3及AhR核转位）、Western blot（检测IDO1、TF、AhR、CYP1A1）、mRNA测序（肾皮质）、活体显微镜（双光子显微镜评估肾微循环）、多光谱光声断层扫描（MSOT检测肾灌注）、药代动力学分析（LC-MS/MS测定血浆和组织浓度）。

**研究结果**
**3.1 Epa与Siv联合治疗优于单药延长脓毒症小鼠生存期**：在LPS和CLP模型中，联合治疗显著提高72小时生存率（LPS模型42.7%，CLP模型50%），优于Siv单药（40%和25%），而Epa单药仅轻微改善且无统计学意义。
**3.2 Epa与Siv联合治疗显著减轻LPS诱导的炎症和免疫抑制**：联合治疗显著降低血清TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-10水平，增加外周血淋巴细胞和CD3+T细胞数量，减少胸腺T细胞凋亡，降低脾脏和血液中CD3+T细胞和CD11b+单核细胞的PD-1比例，效果优于单药。
**3.3 Epa与Siv联合治疗优于单药减轻LPS诱导的急性肾损伤**：联合治疗显著逆转体重下降，降低相对肾重，降低BUN、β2-MG和NGAL，改善肾组织病理损伤（减少肾小管水肿、炎症浸润和微血栓），RNA-seq揭示其下调补体与凝血通路、糖酵解和HIF-1信号通路，上调氧化磷酸化。
**3.4 新型双靶点IDO1/NE抑制剂IMM-H018的体外发现与表征**：通过片段设计和底物模拟策略合成的IMM-H018，对IDO1和NE的IC₅₀分别为41.4 nM和0.82 μM，对IDO1为可逆非竞争性抑制（与Fe³⁺-血红素结合），对NE为可逆竞争性抑制。
**3.5 IMM-H018通过抑制NE和IDO1活性减轻LPS诱导的脓毒症小鼠细胞因子风暴并恢复免疫稳态**：剂量依赖性地降低血清Kyn/Trp比值和NE活性，抑制TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-10，增加白细胞和淋巴细胞，减少胸腺T细胞凋亡，降低CD4/CD8比值和PD-1表达，在CLP致死模型中预处理显著提高生存率（58.3%），治疗性给药也提高至33.3%。
**3.6 IMM-H018减轻多器官损伤并保护脓毒症相关急性肾损伤**：降低肾、肺、肝指数，减少支气管肺泡灌洗液蛋白浓度和中性粒细胞比例，降低BUN、β2-MG和NGAL，改善肾小管形态和NGAL表达，MSOT显示恢复肾灌注，mRNA测序证实下调TLR-4炎症、糖酵解、血小板聚集和血管通透性相关通路。
**3.7 IMM-H018通过抑制IDO1-Kyn-AhR-TF轴减少肾微血栓形成**：免疫组化显示减少纤维蛋白原和CitH3沉积，降低肾组织Kyn含量，Western blot下调IDO1、TF和CYP1A1，体外实验证明IMM-H018抑制IFN-γ诱导的AhR核转位和TF表达，且Kyn可逆转此效应，AhR拮抗剂CH223191证实TF上调依赖于AhR。
**3.8 IMM-H018通过增强巨噬细胞吞噬和抗原呈递改善二次打击脓毒症小鼠的细菌清除**：二次打击模型中，IMM-H018显著降低外周血细菌载量，降低CD206+ M2型巨噬细胞比例，增加MHC II表达，体外实验证实Kyn降低MHC II，而IMM-H018逆转IL-4诱导的M2极化和MHC II下调，并增强巨噬细胞吞噬荧光标记细菌的能力。
**3.9 IMM-H018改善二次打击脓毒症中的炎症、免疫抑制和急性肾损伤，并预防AKI向CKD转变**：降低炎症因子，恢复淋巴细胞，减轻器官相对重量，减少肾小管损伤评分和NGAL表达，减少纤维连接蛋白沉积。
**3.10 药代动力学研究**：IMM-H018在小鼠和犬中口服生物利用度分别为74.4%和46.7%，清除率低，在AKI模型小鼠肾脏中组织/血浆比>10。
**3.11 IMM-H018具有良好的体内安全性**：2周重复剂量毒性研究（SD大鼠）未引起体重变化、血液学、血清生化或凝血功能异常。

**讨论与结论**
讨论部分指出，该研究首次报道了NE抑制剂与IDO1抑制剂联合治疗脓毒症和SA-AKI的协同效应，并基于此开发了双靶点小分子IMM-H018。与联合治疗相比，IMM-H018在多数疗效终点上表现更优，可能得益于单一分子提供协调的药代动力学暴露和靶点结合。IMM-H018通过抑制IDO1-Kyn-AhR-TF轴减少微血栓，同时抑制NE活性减少NETs形成，从而改善肾灌注和功能。此外，IMM-H018通过减少T细胞凋亡和恢复巨噬细胞功能（增强MHC II表达和吞噬作用）逆转免疫抑制，这在二次感染模型中尤为重要。尽管IDO1抑制剂在肿瘤领域临床试验失败，但脓毒症中免疫抑制的可逆性和IDO1的急性诱导特点使其更适合作为治疗靶点。研究还指出，IMM-H018的口服生物利用度和肾脏高暴露支持其进一步开发，且安全性良好。
**研究结论**：本研究证明，新型双靶点NE和IDO1抑制剂IMM-H018通过抑制IDO1-Kyn-AhR-TF轴和NE活性，延长脓毒症小鼠生存期，增强肾灌注，在原发性脓毒症、继发感染诱导的脓毒症和脓毒症相关肾损伤中发挥保护作用。因此，IMM-H018是一种有前景的治疗候选药物。