CALB2是转移性前列腺癌中的机械抗力基因

《Advanced Science》：CALB2 is a Mechanoresistance Gene in Metastatic Prostate Cancer

　　

目前尚不清楚循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）如何适应并在血流中存活于包括流体剪切应力（Fluid Shear Stress, FSS）在内的机械力下，因此明确使CTCs存活并促进转移的机制的至关重要。为模拟这些力学环境，研究人员通过对LNCaP和PC3前列腺癌细胞系反复施加高强度（High-Intensity, HI）FSS（3950 dyn/cm2）构建了“机械抗力”（Mechanoresistant, MR）细胞系。LNCaP MR细胞获得了显著的HI FSS抗性，表现为凋亡显著减少，而PC3细胞表现出先天抗性。批量RNA测序（Bulk RNA-Sequencing）揭示LNCaP和PC3 MR细胞发展了不同的分子程序。CALB2（calretinin，钙视网膜蛋白）作为选择性在PC3 MR细胞中上调的机械抗力基因出现，CALB2敲除显著降低了重新暴露于HI FSS后的活力。对CALB2高表达的前列腺癌病例分析捕捉到了患者水平的分子异质性，提示这是一种机械适应状态而非统一的侵袭性驱动的肿瘤表型，这与CALB2水平与Gleason评分之间无相关性相一致。在前列腺癌原位小鼠模型中，PC3 MR条件显示出最具侵袭性的早期肿瘤生长和最大的终点肿瘤体积，与增殖增强一致。综上所述，这些发现表明前列腺癌细胞在极端FSS下获得了离散的机械适应表型，揭示了限制转移能力的可靶向通路。

研究背景方面，前列腺癌发生远处转移时患者五年生存率下降约百分之七十，转移级联反应中仅有约百分之零点零一的肿瘤细胞能在血流循环中存活，这归因于循环肿瘤细胞在循环期间经历的生理流体剪切应力、血管壁粘附力及免疫清除等严苛条件。目前大多数关于存活于血流中CTCs分子特征的研究源于晚期去势抵抗性前列腺癌患者的液体活检，难以揭示癌症进展至高分级过程中CTCs的特征变化，且细胞如何感知并翻译血流动力学机械信号即机械传导（Mechanotransduction）以在循环中存活的机制尚未明晰。为此，研究人员旨在通过体外反复施加高强度流体剪切应力构建前列腺癌细胞机械抗力模型，阐明循环肿瘤细胞在转移血流中的适应反应以识别新治疗靶点。

关键技术方法包括使用LNCaP（淋巴结转移来源）与PC3（骨转移来源）两种前列腺癌细胞系，通过注射泵系统以30 G针头灌注产生3950 dyn/cm²的高强度流体剪切应力进行反复处理以构建机械抗力细胞；采用批量RNA测序分析分子程序变化；利用CRISPR/Cas9技术构建CALB2敲除细胞系验证功能；使用Annexin-V/碘化丙啶流式细胞术检测活力与凋亡、Ki67分析增殖、细胞周期分析、免疫荧光检测Piezo1与钙视网膜蛋白表达、Western blot与qPCR验证蛋白及mRNA水平；样本队列来源于TCGA-PRAD（The Cancer Genome Atlas Prostate Adenocarcinoma）、SU2C/PCF Dream Team及Taylor/MSKCC前列腺癌队列；体内实验采用NOD/SCID小鼠建立原位前列腺癌模型并通过生物发光成像监测肿瘤进展。

研究结果如下：

2.1 The Development of Mechanoresistant Cancer Cell Lines

研究人员通过将亲本细胞反复暴露于递增次数的半致死高强度流体剪切应力脉冲并筛选存活群体，成功构建了LNCaP和PC3的机械抗力细胞系，并设置亲本细胞与机械初始（Mechanona?ve, MN）高代次细胞作为对照，经STR谱鉴定确认细胞身份一致性。

2.2 Mechanoresistant LNCaP Cells Demonstrate Significantly Enhanced Viability Following Fluid Shear Stress Exposure

通过AV/PI流式细胞术检测发现，在10次剪切脉冲下LNCaP MR细胞在4小时和24小时后存活率显著高于亲本和MN细胞，而PC3各条件在高达20次脉冲下均维持近不变的高存活率，证实PC3具先天流体剪切应力抗性。

2.3 Morphological Phenotypic Shifts are Observed in Mechanoresistant PC3 Cells

流式细胞术与相位差成像分析显示LNCaP MR形态无显著变化，而PC3 MR在悬浮与贴壁状态下均表现出细胞大小、面积与颗粒度显著降低，圆度略降，呈阿米巴样形态，且EMT比率介于亲本与MN之间呈混合表型。

2.4 High-Intensity Fluid Shear Stress Increases S Phase Activity in the Cell Cycle

Ki67中位荧光强度分析显示MR细胞增殖指数更高，细胞周期分析表明PC3 MR在剪切后24小时S期细胞比例显著增加、G₁期减少，无G₂/M期阻滞；免疫荧光显示MR细胞Piezo1（钙离子门控机械敏感离子通道）表达显著升高且与S期比例及Ki67强度正相关。

2.5 RNA-Sequencing Reveals Distinct Molecular Phenotypes Acquired by the Mechanoresistant Cells

批量RNA测序显示MR细胞获得独特分子表型，CALB2在PC3 MR中显著上调，qPCR与Western blot验证其mRNA与钙视网膜蛋白在PC3 MR中高表达；人组织芯片中腺癌与转移灶钙视网膜蛋白高于正常组织，但表达量与Gleason评分无显著相关，TCGA数据显示CALB2高表达与患者总生存降低相关且不与Gleason评分耦合，呈现患者特异性机械适应状态。

2.6 CALB2 Knockout Reduces PC3 Mechanoresistance

CRISPR/Cas9敲除CALB2后，PC3 MR细胞在20次HI FSS脉冲后存活率显著下降至约百分之三十五，而亲本与MN的KO细胞存活无显著变化，且MR KO细胞Ki67低表达比例增加，证实CALB2对PC3 MR细胞的流体剪切应力存活与增殖维持至关重要。

2.7 Orthotopic Prostate Cancer Study

在NOD/SCID小鼠前列腺前叶原位接种模型中，PC3 MR组早期生物发光信号与终点肿瘤体积大于亲本组，MN组最小；免疫荧光证实原位瘤中MR组钙视网膜蛋白表达最高；各组长程转移极少，与Matrigel及模型局限性有关。

讨论部分总结指出，血流动力学高强度流体剪切应力对肿瘤细胞存活的影响具细胞特异性，LNCaP以坏死为主且抗性为获得性，PC3具先天抗性；PC3 MR的形态缩小与混合EMT表型符合间质到阿米巴转变以增强可塑性；MR细胞未出现既往报道的流体剪切应力诱导的细胞周期阻滞反而加速G₁-S转换，且Piezo1上调与增殖活性正相关；CALB2作为钙缓冲蛋白在PC3 MR中特异性上调，其敲除特异性削弱MR细胞机械存活，且在人多队列中不随Gleason评分变化而反映机械适应异质性；皮下与原位模型均显示MR细胞致瘤性与体内钙视网膜蛋白维持上调，但体内转移受限受微环境与Matrigel影响。

结论部分译为：这项工作代表了开发稳定MR癌细胞系的首次尝试。研究人员在此开始揭示转移过程中血流生理FSS下CTCs在血液中发展的存活策略。转移是一个复杂且被广泛研究的过程，但知识缺口仍持续存在，尤其在循环的这一阶段。这些发现具有重要意义，因为研究人员首次通过约4至5个月反复HI FSS处理开发了MR细胞，并对MR细胞相较亲本与MN对应物获得的适应表型进行了彻底表征。阐明这些特征为理解机械适应性肿瘤细胞如何在转移应激中存活提供了见解，深化了对这一侵袭性细胞群体的认识。RNA测序鉴定出若干候选基因包括CALB2可能参与机械适应或应激响应程序并值得进一步研究，这与CALB2升高肿瘤中观察到的独特转录模式一致。此外，原位模型证明MR细胞在体内仍具致瘤性，钙视网膜蛋白水平呈现与体外相似的规律，因此该模型为未来解析体内机械适应程序奠定了基础。总之，这些发现揭示了前列腺癌中CTCs的机械适应机制，将导向更有效的阻断癌症转移扩散的疗法。