多区域类器官生物样本库揭示乳腺癌中由FAK-ACSL1驱动的阿霉素耐药性及预测性生物标志物

《Advanced Science》：Multi-regional Organoid Biobank Reveals FAK-ACSL1-Driven Doxorubicin-Resistance and Predictive Biomarkers in Breast Cancer

　　

肿瘤间异质性（inter-tumor heterogeneity）与肿瘤内异质性（intra-tumor heterogeneity）对乳腺癌（breast cancer, BC）精准治疗的实现构成了重大挑战。为应对这一问题，研究人员建立了一个活体生物样本库，包含来源于50例患者不同区域的68个患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs），并能够准确维持原始肿瘤的组织学、基因组学及转录组学特征。配对分析显示，在突变负荷、拷贝数改变（copy number alterations, CNAs）和分子亚型方面具有高度一致性，从而同时捕获了肿瘤间异质性与肿瘤内异质性。采用4种临床常用药物进行药物筛选后，观察到显著的反应差异，据此建立了可预测药物敏感性的多基因表达特征。ACSL1被鉴定为阿霉素（Doxorubicin）耐药的关键介导因子，其在恶性上皮细胞中富集，并伴随黏着斑（focal adhesion）/MAPK通路激活及免疫逃逸特征。功能学与机制学分析进一步鉴定出黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）是ACSL1的上游调控因子，并通过ERK和STAT3信号介导耐药。通过药理学方法抑制FAK或ACSL1，可提高耐药PDOs对阿霉素的敏感性。联合治疗在异种移植模型中能够有效降低肿瘤生长并防止转移。临床上，ACSL1高表达与疾病晚期及较差生存显著相关。综上，这些发现界定了乳腺癌异质性，建立了预后生物标志物，并揭示了一种支持合理联合治疗策略的阿霉素耐药机制。

该研究发表于《Advanced Science》，聚焦乳腺癌（breast cancer, BC）精准治疗中长期存在的关键障碍，即肿瘤间异质性与肿瘤内异质性导致的疗效差异和持续耐药。现有乳腺癌分子分型虽可在一定程度上解释疾病生物学差别，但仍难以准确预测个体患者对具体药物的敏感性与耐受性。与此同时，传统模型对肿瘤空间异质性的保留不足，也限制了耐药机制解析和可转化生物标志物开发。因此，建立能够稳定保留原发肿瘤组织学特征、多组学特征及区域差异的患者来源模型，对推动乳腺癌个体化治疗具有重要意义。

围绕这一问题，研究人员构建了一个多区域乳腺癌患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）活体生物样本库，共纳入65例患者的83个肿瘤区域样本，最终成功建立来源于50例患者的68个PDOs。研究显示，该生物样本库在组织病理学、全外显子组、拷贝数变异及转录组层面均高度保留亲本肿瘤特征，能够有效反映乳腺癌的跨患者异质性及同一患者不同区域间的异质性。在此基础上，研究人员对4种临床常用乳腺癌化疗药物进行了系统药敏筛选，发现不同PDOs之间、以及同一患者不同区域PDOs之间，均存在明显的药物应答差异。进一步整合转录组数据与药物反应数据后，研究建立了多基因表达预测特征，并筛选出与阿霉素（Doxorubicin）耐药密切相关的核心分子ACSL1。

为阐明机制，研究进一步证明ACSL1并非单纯相关分子，而是阿霉素耐药的功能性介导因子。单细胞转录组整合分析显示，ACSL1高表达恶性上皮细胞富集于黏着斑（focal adhesion）、细胞周期及MAPK等通路，并伴有免疫逃逸特征。机制实验进一步证实，黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）位于ACSL1上游，FAK激活驱动ACSL1表达，而ACSL1则通过ERK与STAT3信号促进阿霉素耐药。药理学抑制FAK或ACSL1均可增强耐药PDOs对阿霉素的敏感性，且阿霉素联合FAK抑制剂IN10018在异种移植模型中显著抑制原发肿瘤生长并减少肺、肝转移。临床组织样本分析进一步表明，ACSL1及相关信号分子高表达与较高TNM分期、较高级别及更差生存结局相关。由此，研究提出FAK–ACSL1–ERK/STAT3信号轴是乳腺癌阿霉素耐药的重要驱动机制，并提示其作为预测性和治疗性靶点的潜在价值。

本研究主要采用以下关键技术方法：首先，基于中国濮阳油田总医院手术患者样本建立多区域PDOs活体生物样本库；其次，对配对肿瘤组织与PDOs开展全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）和RNA测序（RNA-seq）以评估多组学一致性；再次，实施4种临床药物的PDOs药敏筛选，并应用机器学习模型进行药物反应预测；此外，整合来自88例患者119份原发肿瘤活检、共8个公开数据集的单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）数据，解析ACSL1相关细胞状态与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）互作；最后，结合基因敲低、药理抑制、蛋白印迹、qChIP及PDO来源异种移植模型开展机制验证。

2.1 A Biobank of Organoids Spanning Multiple Regions Accurately Mimics the Tissue and Multi-Omic Features of BC
本部分建立并验证了多区域乳腺癌PDOs生物样本库。研究人员从65例乳腺癌患者的83个肿瘤区域中成功建立68株PDOs，区域层面成功率为81.9%，患者层面成功率为76.9%。这些PDOs覆盖乳腺癌主要分子亚型。H&E染色及免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）结果显示，PDOs与对应原始肿瘤在组织病理形态及ER、PR、Her-2、Ki-67等标志物表达方面高度一致。
在分子层面，研究对16对配对PDOs与肿瘤样本进行WES和RNA-seq分析，发现两者在突变负荷、常见驱动基因突变、突变谱及显著拷贝数改变方面高度一致。PIK3CA、TP53和KMT2C等乳腺癌常见突变在样本库中频繁出现，提示该模型具有较强代表性。突变特征分析还显示DNA错配修复相关signature 6在特定病例中于肿瘤与PDOs间稳定保留。转录组分析进一步表明，配对肿瘤与类器官之间具有较强相关性，癌症相关突变中位一致率达到94.5%，主成分分析（principal component analysis, PCA）和分子亚型分析也支持PDOs对亲本肿瘤谱系与亚型信息的保留。由此可见，该多区域类器官样本库可作为研究乳腺癌异质性的可靠平台。

2.2 Analysis of Important Clinical Agents Uncovers Variability Both Between and Within Tumors in How They Respond to Drugs and Pinpoints Gene Expression Patterns that can Predict This Sensitivity
本部分围绕药物反应异质性及预测模型展开。研究人员使用阿霉素、紫杉醇（paclitaxel）、环磷酰胺（cyclophosphamide）和多西他赛（docetaxel）4种临床常用药物对68个PDOs进行药物筛选，结果显示不同患者之间以及同一患者不同区域之间均存在显著的药物反应差异，提示乳腺癌药敏性具有明显空间与个体异质性。
基于转录组可预测治疗反应的思路，研究将具有RNA-seq和药敏数据匹配的PDOs纳入建模分析。以中位IC50作为阿霉素敏感与耐药分界后，筛得411个与阿霉素敏感性显著相关的基因。进一步利用机器学习框架构建10基因表达特征，并采用按患者分层的留一法交叉验证（leave-one-patient-out cross-validation, LOPO-CV）评估模型，以避免同一患者多区域样本造成信息泄漏。在这一严格验证策略下，阿霉素反应预测随机森林模型获得0.836的AUROC；其他3种药物的预测模型AUROC分别为0.812、0.796和0.820。研究同时分析了与拷贝数变异相关的候选基因与药物敏感性的关系，结果显示此类关联亦存在明显异质性。该部分结果说明，多基因转录特征可作为药物敏感性预测的探索性工具，并为后续耐药机制筛选提供了ACSL1这一关键候选分子。

2.3 ACSL1 Mediates Doxorubicin Resistance
本部分系统解析了ACSL1介导阿霉素耐药的证据与分子机制。研究人员首先基于阿霉素敏感相关基因进行蛋白互作网络（protein–protein interaction, PPI）分析，发现ACSL1处于网络中心位置，且属于前述10基因预测特征之一，因此被选为重点研究对象。
为明确ACSL1所处的细胞环境，研究整合了8个公开数据集、88例患者119份原发肿瘤活检的scRNA-seq数据，构建包含236363个细胞的乳腺肿瘤微环境单细胞图谱。通过典型标志物、SingleR及infercnv分析，研究区分出恶性上皮细胞与非恶性细胞群体。比较ACSL1⁺与ACSL1^?肿瘤细胞后，共鉴定261个差异表达基因。GO和KEGG富集分析表明，ACSL1⁺细胞显著富集于中性粒细胞激活、黏着斑、细胞周期和MAPK信号通路。进一步分析发现，PTK2和MAPK1分别在相关通路中上调，且ACSL1表达与FAK、ERK表达呈正相关。与此同时，ACSL1⁺细胞的GE1和GE6评分更高，提示其可能更易逃避自然杀伤（natural killer, NK）细胞介导的细胞毒作用。
在功能验证方面，肿瘤组织中ACSL1表达高于癌旁组织；在3个阿霉素耐药类器官模型中，敲低ACSL1可显著提高阿霉素敏感性。研究随后结合既往线索和本研究相关性结果，提出FAK可能位于ACSL1上游。IHC结果证实FAK在肿瘤组织中同样高表达；使用FAK抑制剂IN10018可降低FAK磷酸化及ACSL1蛋白表达。更重要的是，IN10018与阿霉素联合处理比单药阿霉素更有效清除耐药类器官，并呈现协同作用。
在下游机制层面，研究发现ACSL1表达与ERK、STAT3信号均呈正相关，敲低ACSL1可降低p-ERK和p-STAT3水平。应用ERK抑制剂U0126和STAT3抑制剂S3I-201均可增强阿霉素敏感性，证明ERK与STAT3是ACSL1介导耐药的重要下游通路。进一步地，研究通过转录因子分析筛得SOX9，并发现敲低ACSL1或应用ACSL1抑制剂triacsin C均可降低SOX9表达。qChIP结果显示SOX9可直接结合ERK和STAT3启动子区域。综合来看，本部分确立了FAK–ACSL1–ERK/STAT3信号轴在乳腺癌阿霉素耐药中的核心作用。

2.4 FAK-ACSL1 Signaling Promotes Doxorubicin Resistance in Breast Cancer Cell Lines and Xenograft Models
本部分将上述机制拓展至细胞系和体内模型。研究人员在MDA-MB-231、SUM159、MCF-7和BT549乳腺癌细胞中观察到，阿霉素处理24 h后可显著诱导ACSL1 mRNA及蛋白表达上升，而正常乳腺上皮细胞MCF10A的基础ACSL1表达明显较低，提示ACSL1参与阿霉素耐药可能具有较广泛的模型适用性。
在体内实验中，研究采用PDO来源细胞构建皮下异种移植模型，当肿瘤体积约达200 mm³后，将动物分为对照组、阿霉素组、IN10018组及联合治疗组。结果显示，阿霉素联合IN10018显著抑制原发肿瘤生长，并减少肺与肝的转移灶数量。蛋白印迹与IHC结果进一步显示，联合治疗组中p-FAK、ACSL1、p-ERK及p-STAT3水平下降，表明FAK–ACSL1信号轴在体内受到有效抑制。与此同时，IN10018治疗还伴随坏死面积减少以及癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast, CAF）标志物α-SMA和Vimentin下降，提示该策略除影响肿瘤细胞内在耐药信号外，还可能调节TME。该部分结果支持FAK抑制可在体内增强阿霉素疗效。

2.5 FAK–ACSL1 Signaling is Associated with Tumor Progression and Remodeling of the Tumor Microenvironment
本部分评估FAK–ACSL1信号轴的临床相关性及其与肿瘤微环境重塑的关系。研究人员在139例乳腺癌临床样本中检测FAK–ACSL1通路蛋白表达，其中包括60对癌与邻近正常组织。结果显示，FAK–ACSL1相关分子在肿瘤组织中显著高表达。IHC分析进一步表明，ACSL1表达与TNM分期和组织学分级呈正相关。利用公开数据库进行Kaplan–Meier生存分析发现，FAK–ACSL1轴高mRNA表达与总体生存（overall survival, OS）、无复发生存（relapse-free survival, RFS）和无远处转移生存（distant metastasis-free survival, DMFS）较差显著相关。
为探讨其与TME互作的关系，研究应用CellPhoneDB分析ACSL1⁺与ACSL1^?肿瘤细胞的细胞间通讯网络。结果显示，ACSL1⁺肿瘤细胞与成纤维细胞、内皮细胞的互作增强，而与B细胞、浆细胞和NK细胞的通讯减少。ACSL1⁺肿瘤细胞还显示CXCL14–CXCR4等与中性粒细胞募集相关的配体-受体对富集；与髓源性抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）之间存在TNFSF12–TNFRSF12A、LGALS9–P4HB、HBEGF–EGFR等多种富集互作；与成纤维细胞之间则富集WNT2–FZD及IGF2相关信号。进一步地，高ACSL1表达与CD66b、α-SMA和Vimentin水平升高相关，从临床样本层面支持其参与微环境重塑。该部分说明，FAK–ACSL1轴不仅与肿瘤进展和不良预后相关，还可能通过协调肿瘤细胞与微环境成分之间的相互作用促进耐药与恶性进展。

讨论部分总结
讨论部分指出，本研究建立的多区域乳腺癌PDOs生物样本库在组织学、基因组学和转录组学层面均高度再现亲本肿瘤，并特别强化了对肿瘤内异质性的刻画能力，这是传统模型常难覆盖的关键特征。依托该平台，研究展示了标准化疗药物应答的显著患者间和肿瘤内差异，并提出可用于药物反应分层的多基因表达特征。
在机制层面，研究明确ACSL1是阿霉素耐药的重要介导因子，既属于预测特征的一部分，又在功能实验中被证明可直接影响药物敏感性。更进一步，研究揭示了此前未充分认识的FAK–ACSL1–ERK/STAT3信号级联，说明FAK通过调控ACSL1并激活ERK与STAT3促进化疗耐药。同时，ACSL1⁺肿瘤细胞表现出免疫逃逸和更强的基质互作特征，提示该信号轴兼具肿瘤细胞内在和微环境依赖的双重作用。
临床层面的证据进一步强化了这一发现的重要性：ACSL1及相关通路分子在肿瘤组织中高表达，并与更晚期分期、更高级别及更差生存相关。研究也指出其局限性主要在于样本量仍有限，尚未对不同病理亚型进行更严格分层，因此当前药物预测特征仍需更大独立队列和前瞻性研究验证。总体而言，该研究为乳腺癌药敏分层、耐药机制解析和联合治疗设计提供了重要依据。

研究结论部分翻译
总之，本研究建立了一个多区域乳腺癌患者来源类器官（PDO）生物样本库，能够准确捕获肿瘤异质性并支持对治疗耐药的功能性解析。利用这一平台，研究人员鉴定出FAK–ACSL1–ERK/STAT3信号轴是驱动阿霉素耐药的核心机制。简而言之，ACSL1既是有价值的预测性生物标志物，也显示出作为治疗干预靶点的潜力。相关预测特征以及联合FAK抑制剂的治疗策略，可为乳腺癌临床治疗提供有前景的线索。