人工选择的细胞分裂素通路转录因子平衡大豆产量与病原菌抗性

《Advanced Science》：An Artificially Selected Cytokinin-Pathway Transcription Factor Balances Soybean Yield and Pathogen Resistance

　　

大豆有助于可持续粮食和饲料生产，但一些现代品种以牺牲抗病性为代价来促进产量。采用自下而上的方法，研究人员证明，RR2b转录因子激活细胞分裂素信号（cytokinin signaling）以促进植物生长和生殖适应性，但抑制抗病性和根瘤形成通路。RR2b在驯化和改良过程中被人工选择，其表达水平与启动子中的ATT重复序列多态性相关。大多数野生大豆和地方品种具有较多或较少的ATT重复：重复较多导致RR2b表达弱、产量低且对大豆细菌性疫病的抗性增强，重复较少则导致RR2b表达强、产量高但疫病抗性降低。而优良品种通过适度的RR2b表达和若干ATT重复来平衡产量与防御。这赋予不同单倍型中RR2b功能的对比，以响应对比选择压力，并为解耦产量与疫病抗性之间的权衡以提高作物生产力提供了见解。

**论文解读：《Advanced Science》发表——人工选择的大豆细胞分裂素通路转录因子RR2b平衡产量与病原菌抗性**

**研究背景与问题**

作物驯化是人类文明的重要里程碑，但驯化过程中的人工选择常导致遗传多样性下降，使得高产与抗病性难以兼得。大豆（*Glycine max*）作为全球重要的油料和饲料作物，其病害每年造成超250亿美元损失。现代大豆品种往往优先选择产量性状，却牺牲了抗病性，这成为育种中的关键瓶颈。以往研究多采用自上而下的遗传定位方法（如GWAS、连锁不平衡作图）鉴定驯化相关基因，但这类方法主要识别效应大的“低垂果实”基因。相比之下，自下而上的方法（群体遗传学扫描选择信号）能发现更多潜在驯化位点，但功能验证复杂。细胞分裂素（cytokinin）作为植物生长激素，调控多种农艺性状，其信号通路中的B型响应调节因子（type-B RRs）是转录因子，但它们在调控大豆产量与抗病性平衡中的具体作用尚不清楚。本研究旨在通过自下而上的方法，鉴定大豆细胞分裂素通路中一个受人工选择的转录因子RR2b，并阐明其如何协调产量与抗病性。

**研究内容与结论**

研究人员利用群体遗传学分析发现，编码B型响应调节因子转录因子的RR2b基因（Glyma.15G145200）位于一个同时经历驯化和改良选择清除的基因组区域，该区域还包含10个抗病或干旱诱导基因。RR2b启动子区域存在ATT重复序列插入缺失（InDel），重复数与其表达水平负相关。野生大豆和地方面种中重复数多样，而现代栽培品种中主要保留中等重复数（15-16个）的单倍型HT1，其表达水平适中，平衡了产量与抗病性。功能研究证实，RR2b是细胞分裂素信号的正调控因子，能激活标志基因RR5a和RR9c，并促进种子大小和产量；同时，RR2b通过结合TTGGAAT核心基序，抑制ROS爆发相关基因（如RbohA、RbohC、RbohD）和抗病基因（如PPR40、ATKH8、LRR4）的表达，从而负调控细菌性疫病抗性。此外，RR2b还通过与bHLH63b互作并受上游转录因子ABIG1调控，负调控根瘤形成。田间试验显示，RR2b表达水平与百粒重和产量正相关，与疫病抗性负相关，表明其通过转录水平的精细调控平衡产量与防御。

**重要意义**

该研究揭示了人工选择如何通过调控转录因子表达水平来解耦生长与防御的权衡，为培育高产抗病大豆品种提供了新的分子靶点。论文发表于《Advanced Science》。

**主要技术方法**

1. **群体遗传学分析**：利用已发表的核心大豆种质（296份测序材料）的SNP和InDel数据，计算核苷酸多样性（π）和遗传分化指数（Fst），鉴定选择清除区域。单倍型分析基于启动子ATT重复数。
2. **转基因与基因编辑**：通过农杆菌介导法在Williams 82（W82）背景中构建RR2b过表达（OE）和CRISPR/Cas9敲除（rr2b）稳定转基因株系，以及发根转化系统进行功能验证。
3. **CUT & Tag-seq**：利用RR2b-3xFLAG过表达株系进行原位DNA结合谱分析，结合RNA-seq鉴定直接靶基因。
4. **分子互作分析**：采用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白互作；酵母单杂交（Y1H）和ChIP-qPCR鉴定上游调控因子。
5. **表型与生理测定**：田间多点（北京、石家庄、东营）试验测定产量和百粒重；检测ROS爆发（luminol化学发光法）和细菌性疫病抗性（接种*Pseudomonas syringae* pv. *glycinea*，计数菌落形成单位）。

**研究结果**

**2.1 RR2b在大豆驯化过程中因其转录活性被强烈选择**

通过核苷酸多样性（π）和分化指数（Fst）分析，发现RR2b位于同时经历驯化和改良选择清除的区域，其启动子-100 bp处存在ATT重复序列插入缺失。根据重复数分为三个单倍型：HT1（15-16个重复，在栽培品种中占90%）、HT2（≤14个重复，高表达）、HT3（≥17个重复，低表达）。GUS报告基因和双荧光素酶实验表明，RR2b启动子活性与ATT重复数负相关，HT2表达最高，HT3最低。在自然群体中，HT2在野生大豆中频率28%，在地方面种中降至3%，在栽培品种中仅1%，而HT1频率从野生大豆36%升至栽培品种90%，表明HT1是人工选择的优良单倍型。

**2.2 RR2b是细胞分裂素信号通路的转录激活因子**

RR2b定位于细胞核，其DDK结构域负责核定位。过表达RR2b导致株高变矮、根长对细胞分裂素类似物BAP超敏感，敲除则相反，且RR2b能激活细胞分裂素通路标志基因RR5a和RR9c。细胞分裂素含量测定显示，RR2b过表达植株地上部trans-zeatin（tZ）含量降低、根部升高，而敲除突变体地上部tZ升高。酵母转录激活实验表明，RR2b C端26个氨基酸（623-648位）足以且必需其转录活性。这些结果证实RR2b是细胞分裂素信号的正调控因子。

**2.3 RR2b作为转录抑制因子抑制大豆抗病通路并减弱ROS爆发**

CUT & Tag分析显示RR2b结合核心基序TTGGAAT，不同于经典GARP基序。RNA-seq发现差异表达基因富集于抗病通路，包括PPR40、ATKH8、LRR4等已知抗病基因，它们在rr2b突变体中上调、在过表达株系中下调。EMSA和双荧光素酶实验证实RR2b直接结合这些基因启动子并抑制其表达。表型上，rr2b突变体对*Pseudomonas syringae* pv. *glycinea*抗性增强，过表达株系更感病，且flg22诱导的ROS爆发在rr2b中增强、在过表达株系中减弱。进一步发现RR2b直接抑制RbohA、RbohC、RbohD基因表达，从而减弱ROS爆发。与拟南芥ARR2的比较表明RR2b具有物种特异性。

**2.4 RR2b平衡大豆产量与病原菌抗性**

田间试验（2023-2024年，北京、石家庄、东营）表明，rr2b突变体产量降低、百粒重减小，RR2b过表达株系产量和百粒重增加。在不同大豆种质中，RR2b启动子ATT重复数越少（表达越高），单株产量和百粒重越高，但对细菌性疫病的抗性越低。SoyOmics数据库分析（308份栽培品种和211份地方面种）进一步证实HT1（少重复）单株产量高于HT3（多重复）。这些结果表明RR2b转录水平与产量正相关，与疫病抗性负相关。

**2.5 ABIG1–RR2b–bHLH63通路调控大豆根瘤形成**

rr2b突变体根瘤数多于野生型，过表达株系根瘤数减少，且根瘤标志基因NINa、NINb、ENOD40-1等表达在rr2b中上调、在过表达中下调。CUT & Tag鉴定到根瘤相关基因CEP9和NRLK，EMSA和双荧光素酶实验证实RR2b直接结合并抑制其表达。酵母双杂交筛选到RR2b互作蛋白bHLH63b，BiFC、LCI和Co-IP验证互作，bHLH63b过表达导致根瘤减少。酵母单杂交和ChIP-qPCR发现上游转录因子ABIG1能结合RR2b启动子并抑制其表达，ABIG1过表达促进根瘤形成。因此，ABIG1–RR2b–bHLH63通路负调控大豆根瘤形成。

**总结讨论与结论**

**总结讨论：** 本研究揭示了RR2b通过增加种子大小正向影响产量，同时通过抑制PTI相关的ROS爆发负调控疫病抗性，并负调控根瘤形成。该转录因子在驯化过程中基于转录水平被人工选择，平衡了产量与抗病性，为优化大豆产量和抗性提供了有前景的靶点。RR2b结合基序TTGGAAT不同于经典B型RR基序，暗示其可能通过不同机制调控下游基因。其N端结构域抑制C端转录活性，而C端26个氨基酸短域足以维持活性，为功能机制研究提供了新见解。在驯化过程中，高产量单倍型HT2在早期驯化中丢失，高抗病单倍型HT3在改良中减少，而HT1实现了平衡。与拟南芥ARR2的正调控作用不同，RR2b通过RBOH依赖的ROS爆发发挥负调控作用，可能与物种差异或根瘤类型有关。解耦RR2b多效性的三种策略包括：靶向顺式调控元件改变表达时空特异性、区分不同蛋白功能域、鉴定更多下游靶基因。

**研究结论：** 研究人员证明，RR2b通过增加种子大小正向影响大豆产量，同时通过抑制PTI典型的ROS爆发负调控疫病抗性，并负调控根瘤形成。该转录因子在大豆驯化过程中基于其转录水平被人工选择，并平衡了产量与疫病抗性，使其成为优化大豆产量和抗性的有前景靶点。