ZBTB11通过激活FBXO28介导的MST1降解和抑制Hippo信号促进乳腺癌进展

《Advanced Science》：ZBTB11 Promotes Breast Cancer Progression by Activating FBXO28-Mediated MST1 Degradation and Suppressing Hippo Signaling

　　

上皮-间充质转化（EMT）是乳腺癌进展的关键驱动因素，然而调控Hippo信号的上游转录和泛素介导机制尚未完全明确。在本研究中，研究人员确定了一个调控轴，其中转录因子ZBTB11通过增强F-box蛋白FBXO28的表达促进乳腺癌的侵袭性。ZBTB11直接结合FBXO28启动子并增加其转录，导致FBXO28蛋白水平升高。研究人员显示，FBXO28作为E3泛素连接酶，靶向核心Hippo激酶MST1进行K48连接的泛素化和蛋白酶体降解。MST1的减少减弱了Hippo通路活性，导致Yes相关蛋白（YAP）和含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）的磷酸化降低和核积累增强，进而激活EMT相关基因表达。功能上，破坏ZBTB11-FBXO28-MST1轴在体外和体内抑制EMT、迁移、侵袭和肿瘤生长，而重新引入FBXO28或耗尽MST1逆转这些效应。总之，研究人员的发现揭示了一个先前未被认识的转录-泛素化级联反应，该级联反应调控Hippo信号并促进乳腺癌进展，强调该轴作为一个候选治疗脆弱性，需要进一步验证以限制转移。

研究背景：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，转移是其主要致死原因。上皮-间充质转化（EMT）是癌细胞获得迁移和侵袭能力的关键程序，但调控EMT的上游转录机制与泛素介导的翻译后修饰如何整合尚不完全清楚。Hippo信号通路是一个核心的肿瘤抑制网络，其核心激酶MST1/2和LATS1/2通过磷酸化YAP/TAZ促进其细胞质滞留和降解，抑制肿瘤进展。然而，控制MST1稳定性的机制，特别是F-box蛋白是否直接调控MST1并抑制Hippo信号，此前未知。转录因子ZBTB11在多种生物学过程中发挥作用，但其在乳腺癌中的直接转录靶点和下游信号通路，尤其是是否通过激活E3连接酶降解MST1来驱动EMT和转移，仍是一个未解决的问题。基于这些空白，研究人员假设ZBTB11通过转录激活下游效应器调控Hippo信号，进而促进乳腺癌进展。

研究内容与结论：研究人员通过配对原发-转移病灶RNA-seq发现ZBTB11是转移灶中上调最显著的基因，并在多中心队列中验证其高表达与不良预后相关。功能实验表明，ZBTB11敲低抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生长和肺转移，而ZBTB11过表达在低本底表达的细胞中才显现促癌效应。机制上，ZBTB11通过锌指结构域直接结合FBXO28启动子并转录激活FBXO28。FBXO28作为SCF E3连接酶复合物的底物识别亚基，直接与MST1相互作用，通过其C1区域和MST1的M区域介导，促进MST1的K48连接泛素化和蛋白酶体降解。MST1降解导致Hippo通路抑制，LATS1、YAP和TAZ磷酸化降低，YAP/TAZ核积累增加，进而激活EMT相关基因CCN1和CCN2表达。回补实验证实FBXO28是ZBTB11的下游关键效应器，而MST1是FBXO28介导Hippo抑制和肿瘤表型的主要底物。临床组织芯片分析表明，ZBTB11高表达与FBXO28高表达和MST1低表达显著相关，三者联合标志物可更有效分层患者预后。Verteporfin抑制YAP/TAZ转录活性可阻断该轴下游效应。该研究发表在《Advanced Science》。

主要关键技术方法：研究人员基于5对原发乳腺癌及匹配转移淋巴结的RNA-seq筛选差异基因；利用35对乳腺癌-癌旁组织进行RT-qPCR验证，8对组织进行Western blot，180对组织构建组织芯片（TMA）进行免疫组化（IHC）及预后分析，另20例样本独立验证。方法包括：ChIP-qPCR鉴定ZBTB11与FBXO28启动子结合；双荧光素酶报告实验验证转录激活；Co-IP和LC-MS/MS鉴定FBXO28互作蛋白；GST pull-down和BiFC验证直接相互作用；结构域缺失突变体定位结合区域；体内泛素化实验和CHX追踪评估MST1稳定性；体内异种移植和肺转移模型评估功能。

研究结果：
2.1 ZBTB11在转移性乳腺癌中上调，在原发肿瘤中升高且具有预后相关性：通过5对配对RNA-seq发现ZBTB11是转移灶中最显著上调基因，GSEA显示EMT通路富集。TCGA等队列验证ZBTB11在肿瘤中高表达，高表达患者总生存和无病生存更差，多因素Cox回归确认其为独立预后因子。
2.2 ZBTB11增强乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移能力：敲低ZBTB11抑制MDA-MB-231和CAL51细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭及体内肿瘤生长和肺转移；过表达在低本底MCF7和SK-BR-3细胞中促进恶性表型，而在高本底细胞中无额外效应，提示存在阈值效应。
2.3 ZBTB11调控上皮-间充质转化：敲低ZBTB11增加E-cadherin，减少N-cadherin、Vimentin和Slug；过表达在低本底细胞中诱导EMT样变化。临床TMA中ZBTB11高表达与E-cadherin低表达和Vimentin高表达显著相关。
2.4 ZBTB11通过结合启动子转录激活FBXO28：ZBTB11敲低后的RNA-seq结合多数据库预测，鉴定FBXO28为下游靶点。ZBTB11通过锌指结构域直接结合FBXO28启动子“GGAAG”基序，促进转录。
2.5 FBXO28促进乳腺癌增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长：敲低FBXO28抑制MDA-MB-231细胞恶性表型，过表达在CAL51细胞中增强；在MCF7和SK-BR-3细胞中过表达FBXO28同样促进增殖和克隆形成。
2.6 FBXO28介导ZBTB11依赖的EMT和恶性表型：在ZBTB11敲低细胞中回补FBXO28逆转EMT标志物变化、恢复增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生长和肺转移；在ZBTB11过表达的MCF7和SK-BR-3细胞中敲低FBXO28减弱ZBTB11诱导的EMT和促癌效应。
2.7 FBXO28直接与MST1相互作用并调控其蛋白稳定性：Co-IP和LC-MS/MS鉴定MST1为FBXO28互作蛋白；FBXO28不影响MST1 mRNA水平，MG132消除蛋白变化；BiFC、GST pull-down和Co-IP确认直接结合；FBXO28的C1区域和MST1的M区域为结合必需。
2.8 FBXO28促进MST1的K48连接泛素化和蛋白酶体降解：FBXO28敲低减少MST1泛素化，过表达增加；CHX追踪显示FBXO28缩短MST1半衰期；K48突变泛素阻断泛素化；FBXO28通过F-box与SKP1结合形成SCF复合体。
2.9 FBXO28-MST1轴调控Hippo通路激活、YAP/TAZ核积累和转录输出：ZBTB11或FBXO28敲低增加MST1和磷酸化MST1，提高LATS1/YAP/TAZ磷酸化，减少YAP/TAZ核定位；回补实验确认层级；FBXO28-MST1调控CCN1和CCN2表达；体内回补实验证实MST1介导FBXO28驱动的肿瘤进展。
2.10 ZBTB11-FBXO28-MST1轴预测患者预后并揭示下游YAP依赖性：Verteporfin抑制YAP/TAZ可阻断该轴促肿瘤效应；TMA中ZBTB11与FBXO28正相关，与MST1负相关；联合标志物（ZBTB11高/FBXO28高/MST1低）识别最差预后亚组。

讨论总结与结论：该研究定义了ZBTB11-FBXO28-MST1转录-泛素化级联，通过抑制Hippo信号促进YAP/TAZ活性、EMT和转移。ZBTB11在转移灶中上调，其促癌效应具有背景依赖性。FBXO28优先靶向MST1而非其他Hippo激酶。临床数据支持该轴作为预后生物标志物和候选治疗脆弱性。局限性包括需要更多亚型模型、精确结合位点解析及直接靶向策略的体内验证。结论：研究人员发现ZBTB11通过激活FBXO28介导的MST1降解和Hippo抑制驱动乳腺癌进展，ZBTB11高/FBXO28高/MST1低组合标志物识别预后最差患者，该轴是潜在治疗靶点。