利用工程化合成抗体片段通过表位引导检测分子黏合剂诱导的三元复合物

《Journal of Molecular Biology》：Epitope-guided detection of a molecular glue-induced ternary complex using engineered synthetic antibody fragments

　　摘要：分子胶是一类小分子，能够调节那些缺乏传统配体结合位点的蛋白质。分子胶的显著特点在于它们能够在较弱或新形成的蛋白质-蛋白质界面实现协同结合。尽管人们对这类化合物越来越感兴趣，但用于从细胞中的异质群体中选择性分离出由分子胶诱导的天然蛋白质复合物的工具仍然有限。本研究通过噬菌体展示技术制备了合成抗体片段（Fab）报告分子，从而能够选择性地检测雷帕霉素诱导的FKBP12-mTOR三聚体复合物这一作为模型分子胶诱导的蛋白质复合物。晶体学研究揭示了三种不同的表位识别机制的结构基础，这些机制可通过合成结合剂来监测雷帕霉素的分子胶活性。Fab-1A和Fab-2C分别利用雷帕霉素诱导的变构效应和相互作用介导的表位，以较低到中等的精确度检测到三聚体复合物的形成。而Fab-4R则通过感知连接FKBP12-雷帕霉素-mTOR结构的雷帕霉素介导的连接表位，展现出更高的准确性作为分子胶报告分子。结构引导的突变研究表明，Fab-4R的旁表位通过直接位于FKBP12与mTOR之间条件性界面上的热点相互作用，赋予其对三聚体复合物的特异性。基于细胞的免疫沉淀实验表明，Fab-4R和scFv-4R均可作为多功能分子探针，以高保真度和皮摩尔级灵敏度检测雷帕霉素对FKBP12依赖的mTOR抑制作用。总体而言，这些研究结果阐明了多种基于抗体的分子胶报告分子的识别特性，并凸显了合成结合剂在检测蛋白质组中条件性形成的表位方面的多功能性。

引言：条件性形成的蛋白质-蛋白质相互作用对于细胞信号传导通路中的信息传递至关重要。依赖于特定环境的蛋白质-蛋白质相互作用驱动着众多大分子复合物的活性，这些复合物负责调控细胞的增殖、转录、翻译、代谢、运输以及信号传导等过程，从而使细胞能够动态感知并响应外界刺激。虽然蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂已被广泛研究作为具有前景的治疗药物，但由于其作用表面较大且动态变化、药物特性不佳以及生物利用度低等问题，其应用效果一直受限。分子胶则是一类小分子，它们通过人工诱导较弱或新形成的蛋白质-蛋白质相互作用，为调节蛋白质-蛋白质相互作用网络提供了独特的方法。这类化合物通常具有协同结合模式，即被分子胶结合的靶蛋白新暴露出的表面会对另一种蛋白质表现出更高的互补性和亲和力。这种作用机制尤其适用于那些缺乏合适配体结合腔的难以攻击的目标。然而，合理设计分子胶的工作仍受到缺乏通用设计原则以及结构-活性关系难以预测的制约，因此迄今为止大多数分子胶都是偶然发现的。雷帕霉素是一种大环天然产物，可作为典型的分子胶。它通过非共价方式将12千道尔顿的FK506结合蛋白（FKBP12）与雷帕霉素作用靶点（mTORFRB）的底物招募结构域相连。作为最早被描述的分子胶之一，雷帕霉素因其能够以纳摩尔级别精确调节mTOR底物磷酸化及蛋白质-蛋白质相互作用，而在发现mTOR的过程中发挥了关键作用。尽管雷帕霉素及其衍生物已获得美国食品药品监督管理局的批准，可用于治疗器官移植排斥反应、多种癌症以及其他生长障碍，如结节性硬化症复合体和淋巴管平滑肌瘤病，但其临床应用仍受到一些靶向性不良副作用的限制。深入理解雷帕霉素介导的mTOR抑制作用背后的分子机制，对于开发既能保持雷帕霉素的益处又能降低毒性的新分子至关重要。mTOR的功能依赖于一系列高度协调的相应蛋白质-蛋白质相互作用。mTOR作为核心催化亚基，存在于两种在结构和功能上都有差异的多亚基复合物中，即mTOR复合物1和mTOR复合物2。FKBP12-雷帕霉素对mTOR的抑制会通过不同机制改变mTORC1和mTORC2核心亚基Raptor和Rictor之间的相互作用。FKBP12-雷帕霉素与mTORC1结合后，会导致mTOR-Raptor相互作用的快速变构不稳定。尽管这一现象早已被描述，但FKBP12-雷帕霉素对Raptor的变构调节背后的分子机制仍未明确。相比之下，mTORC2对雷帕霉素的抑制作用极为不敏感，因为FKBP12-雷帕霉素的结合位点会被Rictor遮蔽。在长时间暴露于雷帕霉素的情况下，FKBP12-雷帕霉素复合物会与新合成的mTOR分子结合，阻碍Rictor与mTORC2的结合。不过，有些细胞系对雷帕霉素抑制mTORC2的作用具有抗性，而有些则极为敏感，这进一步凸显了将分子胶行为从实验室环境转化为活体系统所面临的复杂性。雷帕霉素复杂的抑制机制体现了在基于细胞的分子胶特性研究中所面临的若干挑战。包括纳米荧光素酶生物发光共振能量转移、荧光共振能量转移以及分裂荧光素酶互补法在内的技术，能够实现高通量检测诱导的蛋白质邻近性，从而用于筛选细胞中的分子胶。然而，这些方法通常无法解析由分子胶介导的高阶蛋白质复合物组装过程中伴随发生的复杂蛋白质-蛋白质相互作用重构。本研究探讨了利用工程化合成抗体作为选择性识别型分子胶报告分子的应用，无需进行基因操作即可实现无标签的细胞内目标复合物的分离与表征。虽然合成抗体此前已被用作研究多亚基蛋白质复合物的强大亲和力试剂，但其在分子胶介导的相互作用研究中的应用尚待开发。本研究采用定制的噬菌体展示技术路线，制备了能够选择性识别由分子胶诱导的FKBP12-雷帕霉素-mTOR三聚体复合物的合成抗体片段。这些工程化抗体片段既可作为结晶伴侣，也可作为亲和力报告分子，有助于建立从结构到功能的框架，从而理解雷帕霉素分子胶活性低精度和高精度检测的关键要素。此外，通过将抗体片段转换为单链抗体，还实现了高精度的细胞内雷帕霉素传感器。筛选策略首先是对初始文库中与FKBP12或mTORFRB结构域结合的噬菌体进行去除，然后再从剩余的噬菌体中筛选出能与雷帕霉素诱导的三聚体复合物结合的结合剂。通过这一技术路线，从人类细胞中分别鉴定出了Fab-1A、Fab-2C和Fab-4R三种具有不同选择性的结合剂，它们能够分别以低、中、高的选择性区分内源性的FKBP12-雷帕霉素-mTOR复合物的形成。这些结合剂的分子识别特性是通过X射线晶体学、生物物理结合特性分析以及基于细胞的免疫沉淀实验相结合的方式加以研究的。总体而言，这项研究表明，合成抗体通过条件性识别的表位，可作为一种有效的策略，用于监测由分子胶诱导的三聚体复合物的形成。

结果部分：生成合成抗体片段报告分子以检测雷帕霉素的分子胶活性。雷帕霉素促使FKBP12与mTOR非共价结合，是分子胶诱导的三聚体复合物的典型例子。该复合物被用来制备具有条件性识别表位的抗体片段，这些表位能根据三聚体复合物的形成状态引发不同的结合反应。FKBP12以及mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合结构域。Fab-2C利用Raptor的变构不稳定作为相互作用介导的表位识别机制。mTORC1对细胞生长和代谢的调控依赖于mTOR与核心亚基Raptor之间的相互作用。FKBP12-雷帕霉素通过变构方式破坏mTOR与Raptor之间的相互作用，从而抑制Raptor介导的功能，并可能使mTOR与Raptor界面处出现条件性可访问的表位空间。为了了解这一机制，研究者们分别以1.90埃和2.18埃的分辨率确定了与mTORFRB结合的Fab-1A和Fab-2C的晶体结构。Fab-4R识别FKBP12-雷帕霉素-mTORFRB三聚体复合物的结构基础。此前已有研究报道了多种能够识别复合物特异性或跨蛋白质连接区域的表位的抗体。然而，这些复合物特异性结合剂如何选择性地识别其条件性可访问的表位，其结构机制仍不甚清楚。为了解析Fab-4R所表现出的逻辑门控式识别特性，研究者们以2.05埃的分辨率确定了Fab-4R与FKBP12-雷帕霉素-mTORFRB结合的晶体结构。Fab-4R识别跨连接表位的结构决定因素。研究者们采用定量结构分析方法，比较了Fab-4R与FKBP12-雷帕霉素-mTORFRB结合后的结构与其他高分辨率晶体或冷冻电镜下显示的与多种抗原结合的抗体结构之间的差异。他们从结构抗体数据库中筛选出了那些含有Fab、scFv或纳米抗体结合剂且与一种或多种抗原结合的、分辨率在3.0埃及以下的结构。最终共获得了2,514个此类结构。Fab-4R和scFv-4R是灵敏的细胞内mTOR抑制探针。为了探究在天然mTOR结构背景下Fab-4R的表位是否可被识别，研究者们将Fab-4R的晶体结构与之前已确定的mTOR的冷冻电镜结构进行了对比分析。分析结果显示，Fab-4R能够结合并分离出细胞来源的FKBP12-雷帕霉素-mTOR复合物。为了进一步评估Fab-4R检测由FKBP12-雷帕霉素结合的内源性mTOR复合物的能力，研究者们进行了基于细胞的免疫沉淀实验。

讨论部分：由于分子胶能够调节那些缺乏传统配体结合位点的蛋白质，因此基于分子胶的治疗策略引起了广泛关注。该领域的最新进展进一步强调了细胞内分子胶靶标在结构和组成上的多样性——包括E3泛素连接酶复合物——对新生底物招募、降解效率以及下游生物学效应的影响。尽管取得了这些进展，但目前仍存在一个关键挑战，即……材料与方法部分：DNA构建体的制备。如前文所述，研究者们分别制备了SNAP-FKBP12-6xHis、SNAP-mTORFRB-6xHis以及10xHis-TEV-mTORFRB这几种DNA构建体。下文所述的聚合酶链反应和连接反应则是使用Takara Bio公司的In-Fusion HD克隆试剂盒完成的。通过PCR扩增出编码FKBP12-(G4S)4-FRB序列的gBlock（IDT），并将其克隆到pekD40载体的SmaI位点上。该构建体还被设计为在C端添加6xHis标签。FKBP12则被克隆到pHFT2载体的BamHI/XhoI位点上。结晶与结构测定部分：在结晶之前，Fab-1A和Fab-2C经过了修饰，加入了晶体κ轻链修饰基团。Fab-1A-mTORFRB和Fab-2C-mTORFRB复合物是在10 mM HEPES、pH 7.2、150 mM NaCl的缓冲液中，使用Sephadex 200柱通过尺寸排阻色谱法进行纯化的。纯化的复合物在用Mosquito Crystal Robot（TTP Labtech）进行结晶筛选之前，其浓度会被提高到至少15 - 20毫克/毫升。Fab-1A-mTORFRB复合物的结晶条件为0.2 M铵盐溶液。坐标数据已存储在蛋白质数据银行中，编号分别为9PIW、9PIU和9PJ1。表面等离子体共振实验：研究者们使用Bruker公司的MASS-1仪器进行了表面等离子体共振实验。FKBP12和mTORFRB通过6xHis标签固定在Ni-NTA传感器（Sierra Sensors）表面。为了测定Fab-4R的结合动力学，研究者们在存在200 nM雷帕霉素的条件下，固定FKBP12和mTORFRB，然后进行了多点实验。作者贡献声明：Kelly M. O’Leary负责撰写原始稿件、开展研究、进行正式分析以及概念构思；Tomasz Slezak负责开展研究以及进行正式分析；Duc Anh Le负责开展研究工作；Anthony A. Kossiakoff负责撰写原始稿件以及进行概念构思。利益冲突声明：作者们声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。致谢：我们感谢芝加哥大学Sanger DNA测序中心以及芝加哥大学集成光学显微镜中心（RRID: SCR_019197）所提供的服务支持。同时，我们也感谢Joseph Piccirilli实验室允许我们使用结晶机器人。X射线衍射数据是在阿贡国家实验室的NECAT 24-ID-E光束线上获取的。GM/CA@APS项目得到了美国国家癌症研究所（ACB-12002）以及美国国家研究所的资助。Kelly M. O’Leary|Tomasz Slezak|Duc Anh Le|Anthony A. Kossiakoff，美国伊利诺伊州芝加哥市，芝加哥大学生物化学与分子生物学系，邮编60637。