TBX5-p.G125R出生后失调起搏心肌细胞状态与功能

《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：TBX5-p.G125R postnatally deregulates pacemaker cardiomyocyte state and function

　　

摘要：在呈现非典型Holt-Oram综合征的一个家族成员中鉴定出的致病性错义TBX5（T-box转录因子5）变异体p.G125R的杂合性，与室上性心律失常（包括心房颤动和窦性心律紊乱）相关。Tbx5^+/G125R小鼠重现了患者表型的主要方面，包括心房心律失常易感性增加，并揭示了成年心房心肌细胞转录调控网络和表观遗传状态的失调。由于TBX5也与窦房结和心房的发展及功能有关，而且患者和Tbx5^+/G125R小鼠均表现出窦房结功能障碍的迹象，研究人员利用空间转录组学探索了TBX5-p.G125R对胎儿和成年窦房结及心房中基因表达的影响。研究人员发现，TBX5-p.G125R介导的心房转录改变在出生前就已启动，最终在成年小鼠中导致心房心律失常，而产前窦房结的发育和转录组则基本未受影响。然而，TBX5-p.G125R在成年窦房结起搏心肌细胞中诱导了一种转录状态改变，改变了起搏电生理学并破坏了内在窦房结功能。研究人员得出结论，TBX5-p.G125R在出生后窦房结转录状态中驱动的改变，导致了成年Tbx5^+/G125R小鼠的窦房结功能障碍和心房心律失常。这强调了TBX5在维持起搏心肌细胞状态和功能中的关键作用。

**论文解读**

**1. 研究背景与问题**

T-box转录因子TBX5是心脏发育和功能的关键调控因子，其剂量依赖性调节心房和心脏传导系统（包括窦房结）的发育、特性和功能。TBX5的致病性变异与Holt-Oram综合征（HOS）相关，患者常伴有先天性心脏缺陷和心律紊乱。研究人员先前在一个表现为非典型HOS的荷兰家族中，鉴定出一个位于TBX5 T-box结构域的功能获得性错义变异体c.373G>A (p.G125R)。该家族成员表现出显著的室上性心律失常，包括早发性心房颤动、窦性心动过缓、窦性停搏等，提示存在窦房结功能障碍。通过构建携带该变异的Tbx5^+/G125R小鼠模型，研究人员重现了患者的主要表型，并发现该变异改变了TBX5的DNA结合和协同作用特性，进而影响了成年心房转录组和表观遗传状态。然而，TBX5-p.G125R对窦房结，特别是对起搏心肌细胞（PC）的发育、转录状态和功能的直接影响尚不明确。因此，本研究旨在阐明TBX5-p.G125R如何通过影响窦房结和心房的发育及稳态，最终导致心律失常表型。

**2. 研究内容与结论**

研究人员利用空间转录组学技术，系统比较了Tbx5^+/G125R小鼠与野生型小鼠在胎儿期（E17.5）和成年期，其窦房结、右心房和左心房的基因表达谱。研究发现，TBX5-p.G125R导致的心房转录失调在出生前就已启动并持续至成年，但产前窦房结的发育和转录组基本未受影响。然而，在成年小鼠中，该变异在窦房结起搏心肌细胞中诱导了独特的转录状态，并伴随起搏电生理特性的改变和内在窦房结功能的紊乱。这些发现表明，TBX5-p.G125R对心房和窦房结的影响具有时空特异性，其通过破坏出生后窦房结起搏心肌细胞的转录状态，进而导致窦房结功能障碍和心房心律失常。该研究强调了TBX5在维持起搏心肌细胞状态和功能中的关键作用。论文发表在《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》。

**2.1 主要关键技术与方法**

* **动物模型：** 使用CRISPR-Cas9技术构建的Tbx5^+/G125R小鼠模型，以及用于标记起搏心肌细胞的Tbx3^+/Venus报告基因小鼠。
* **空间转录组学：** 采用Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) 技术，对福尔马林固定、石蜡包埋的胎儿和成年小鼠心脏切片进行全转录组分析，以定位不同心脏区域（窦房结、心房、心室）的基因表达变化。
* **体内电生理学：** 通过体表心电图记录和经食管心房起搏，在清醒和自主神经系统阻断状态下，评估小鼠的窦房结功能和心房电活动。
* **细胞电生理学：** 采用膜片钳技术，对从成年小鼠分离的单个Venus阳性起搏心肌细胞进行动作电位记录和分析，以评估其电生理特性。

**2.2 研究结果**

**2.2.1. 胎儿Tbx5^+/G125R小鼠窦房结基因表达未改变**
通过三维重建HCN4表达域和组织学染色，研究人员发现Tbx5^+/G125R小鼠胚胎期（E17.5）的窦房结形态和体积与野生型相比无显著差异。空间转录组学分析进一步证实，胎儿期Tbx5^+/G125R窦房结的转录组与野生型高度相似，仅有少量基因差异表达。相比之下，其左心房和右心房已出现显著的转录失调，包括多种转录因子和离子通道基因（如Scn5a）的表达改变，以及心肌细胞结构相关基因本体（GO）术语的富集减少。这表明TBX5-p.G125R对心房的转录影响始于产前，而对窦房结的发育和转录影响在产前阶段尚不明显。

**2.2.2. Tbx5-p.G125R在成年起搏心肌细胞中诱导独特的转录状态**
对成年小鼠心脏的空间转录组学分析显示，Tbx5^+/G125R小鼠的左心房和右心房仍存在广泛的转录失调，其中右心房差异表达基因的GO分析显示了与代谢和钙离子内流相关的术语变化。更重要的是，与胎儿期不同，成年Tbx5^+/G125R窦房结的基因表达受到显著影响，共有630个基因差异表达。GO分析表明，这些基因与起搏心肌细胞动作电位和心脏传导等术语相关。许多关键离子通道基因（如Hcn4, Cacna1h, Scn5a）和转录因子（如Nkx2-5）的表达发生失调。通过与心房差异表达基因的比较，研究人员发现Tbx5^+/G125R窦房结的转录反应在很大程度上是独特的，表明TBX5-p.G125R在起搏心肌细胞中诱导了一种独特的转录状态。

**2.2.3. Tbx5^+/G125R小鼠的内在窦房结功能障碍**
通过体表心电图记录，研究人员发现Tbx5^+/G125R小鼠在静息状态下表现出心率减慢（RR间期延长）、心率变异性增加、PR间期缩短以及P波形态异常（负向P波增多）等窦房结功能障碍特征。在给予阿托品和普萘洛尔以阻断自主神经系统后，Tbx5^+/G125R小鼠的心率减慢和心率变异性增加等现象更加显著，且校正后的窦房结恢复时间（cSNRT）显著延长，而负向P波的发生率则显著降低。这些结果表明，Tbx5^+/G125R小鼠存在内在的窦房结功能障碍，并且自主神经系统部分掩盖了这种功能障碍。

**2.2.4. TBX5-p.G125R失调成年起搏心肌细胞功能**
利用膜片钳技术对分离的单个Venus阳性起搏心肌细胞进行记录，研究人员发现，与野生型细胞相比，Tbx5^+/G125R起搏心肌细胞的自发搏动周期长度变异系数显著增大，表明其节律性变差。同时，其动作电位在20%和50%复极化的时程（APD20和APD50）显著缩短，而动作电位幅度、最大舒张电位和最大上升速率等参数无显著差异。这些电生理学改变与空间转录组学发现的离子通道基因表达失调（如Cacna1h, Hcn4, Kcnh2等）相一致，直接证明了TBX5-p.G125R破坏了起搏心肌细胞的电生理功能。

**3. 讨论与结论**

**讨论总结：**
研究者讨论指出，TBX5-p.G125R对心房和窦房结的影响存在时空差异：产前主要影响心房，而出生后则显著影响窦房结起搏心肌细胞。这种差异可能源于心房和窦房结不同的发育起源、转录因子网络和染色质环境。该变异通过与其它转录因子（如NKX2-5, TBX20）的协同或竞争作用，以及改变其自身DNA结合亲和力，以环境依赖的方式破坏基因调控网络。在窦房结，降低了Nkx2-5的表达可能破坏了SHOX2-NKX2-5-TBX5的调控平衡，影响电冲动从窦房结至心房的传导。膜片钳数据表明，多种离子通道基因（如Cacna1h, Hcn4, Kcnh2）的协同失调是导致起搏心肌细胞自律性不规则和动作电位时程缩短的根本原因，尽管部分电流变化可能相互抵消。此外，心房本身（尤其是右心房）的转录失调也参与了心律失常表型，特别是影响了窦房结-心房交界处的传导。因此，TBX5-p.G125R通过同时损害心房和窦房结起搏心肌细胞的功能，共同导致了心律失常。

**研究结论：**
总之，TBX5-p.G125R在产前即改变了心房转录组，而窦房结发育和起搏心肌细胞转录组最初基本未受影响。然而，在出生后的Tbx5^+/G125R窦房结中，TBX5-p.G125R改变了TBX5靶基因、脱靶基因和结合伴侣的表达，诱导了一种与心房心肌细胞中大部分不同的转录反应。这些改变共同表明，TBX5在维持心房心肌细胞和起搏心肌细胞的状态与功能中发挥着关键作用。