《The Journal of Nutrition》：Neuronal nitirc oxide synthase (nNOS) expression is reduced in skeletal muscle from db/db mice and glucose and fatty acids show differential effects on nNOS regulation and myogenic differentiation
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摘要背景神经元一氧化氮合酶（nNOS，由基因编码）是调控骨骼肌质量的关键因子。然而，糖尿病状态下骨骼肌中nNOS功能失调的机制仍不明确。目的我们在小鼠模型及C2C12肌管中研究了2型糖尿病的典型特征——高血糖和高血脂——对nNOS调控的相对影响。方法研究采用了雄性db/db小鼠和
摘要
背景
神经元一氧化氮合酶（nNOS，由基因编码）是调控骨骼肌质量的关键因子。然而，糖尿病状态下骨骼肌中nNOS功能失调的机制仍不明确。
目的
我们在小鼠模型及C2C12肌管中研究了2型糖尿病的典型特征——高血糖和高血脂——对nNOS调控的相对影响。
方法
研究采用了雄性db/db小鼠和C57BL/6J野生型对照小鼠（每组4只，12周龄），检测了它们的葡萄糖耐量、血液指标、肌肉与脂肪质量、Nos1基因DNA甲基化水平以及mRNA/protein表达情况。C2C12肌管则被置于含葡萄糖（5、25或60 mM）或脂肪酸（0.05–0.75 mM，包括棕榈酸和油酸）的环境中，随后检测其融合指数及mRNA/protein表达水平。所有数据均通过学生t检验或方差分析进行处理。
结果
db/db小鼠的葡萄糖耐量显著下降（升高3倍，P＜0.05），血脂水平也有所上升（甘油三酯水平升高2倍，P＜0.01），且腓肠肌的肌肉质量显著降低（降低46%，P＜0.01）。腓肠肌中的nNOS蛋白表达也相应降低（降低29%，P＜0.01），且其与肌肉质量呈正相关（r=0.87，P＜0.01）。在糖尿病状态的腓肠肌中，Nos1μ的表达显著降低（降低64%，P＜0.01），而基因的DNA甲基化水平则无变化。在所测试的营养因素中，只有0.75 mM的棕榈酸能降低nNOS表达（降低41%，P＜0.05），并抑制C2C12肌管的融合过程（降低61%，P＜0.01）；而油酸则无此类效应。值得注意的是，高血糖并未导致nNOS表达下降。联合处理实验表明，棕榈酸而非葡萄糖才是导致nNOS表达下降的主要因素（降低70%，P＜0.01）。
结论
nNOS信号传导功能受损可能将脂肪过载而非高血糖与2型糖尿病中的肌肉萎缩联系起来，因此该靶点有望用于保护骨骼肌质量。
引言
骨骼肌是人体内最为活跃且可塑性的器官之一，约占人体总重量的40%（1）。衰老（2）、缺乏运动以及2型糖尿病（3）等多种因素都会导致骨骼肌质量下降。骨骼肌在产生机械力量方面起着重要作用，其质量与全因死亡率相关（4），同时也是预测寿命的长短的重要指标（5）。因此，维持骨骼肌质量并了解其萎缩的机制对于保持健康活跃的生活至关重要。
以葡萄糖耐量异常和高血脂为特征的2型糖尿病的全球患病率正在不断上升（6）。患有2型糖尿病的人，其腿部肌肉的质量和力量下降程度要高于非糖尿病患者（3）。此外，较低的骨骼肌质量和腹部肥胖还会进一步增加患2型糖尿病的风险（7）。动物实验表明，2型糖尿病模型小鼠——db/db小鼠的后肢慢缩肌和快缩肌的骨骼肌质量较低，力量生成能力也有所下降（8, 9）。
高血糖和脂毒性是2型糖尿病的典型特征，二者都会导致骨骼肌萎缩（10, 11）。高血糖水平会抑制骨骼肌细胞中的肌生成过程（12, 13）；在无葡萄糖环境下，肌肉卫星细胞的增殖活性要高于正常葡萄糖浓度下的活性（13）。链脲佐菌素诱导的高血糖会通过WWP1/KLF15通路引发肌肉萎缩，这一通路在C2C12细胞中也会受到高血糖的影响而发生调节（14）。棕榈酸是人体内最常见且含量最高的饱和脂肪酸，通常以甘油三酯的形式储存在脂肪组织的脂滴中。它可通过诱发胰岛素抵抗在肌肉细胞中引发脂毒性（15），进而导致细胞损伤和死亡，因此棕榈酸处理可被用于构建2型糖尿病模型（16）。有研究表明，棕榈酸处理会抑制肌管的分化过程（15）。不过，目前尚不清楚这些营养因素，包括葡萄糖毒性及/或脂质堆积，是否真的会导致肌肉萎缩，而且2型糖尿病中营养状况如何调控骨骼肌质量的机制也尚未完全明确。
神经元一氧化氮合酶是骨骼肌中一氧化氮的来源，它是快缩肌纤维中的细胞膜成分（17），同时也能调控葡萄糖稳态和骨骼肌质量。此外，nNOS及其产生的NO信号可能有助于促进骨骼肌对葡萄糖的吸收（18, 19, 20, 21）。在骨骼肌质量调控方面，nNOS能够影响骨骼肌的分化（22）、肥大以及萎缩过程（23, 24），而nNOS基因敲除的小鼠则会出现骨骼肌萎缩和力量生成能力下降的现象（25）。在我们之前的动物研究中，我们发现即使只是长期（1周）的不活动，而非短期（12小时）的不活动，也会导致肌肉萎缩并降低nNOS的表达水平（26）。Bradley等人也发现，2型糖尿病患者的骨骼肌中nNOS蛋白表达水平低于正常人（27），而且即便胰岛素敏感性有所改善，这一下降趋势也并未恢复。因此，nNOS更可能是参与维持骨骼肌质量，而非调控2型糖尿病状态下的骨骼肌葡萄糖稳态。
我们推测，nNOS信号传导功能受损可能是2型糖尿病背景下骨骼肌质量下降的原因之一，而且nNOS的表达本身也可能受到2型糖尿病特征因素的影响，比如高血糖和升高的血脂水平。因此，我们的研究旨在探讨在糖尿病状态下，nNOS表达异常是否与肌肉萎缩有关，同时明确nNOS在2型糖尿病导致肌肉质量下降的机制中的作用。
章节节选
动物实验与伦理审批
所有涉及动物的实验均遵循日本政府的相关法律（第105号）和相关规定（第6号），并且所有实验都获得了佐贺大学动物护理与使用委员会的批准（批准编号：A2022-046-0）。实验所用的小鼠为6周龄的雄性db/db小鼠（BKS.Cg-m+/+Leprdb/Jcl；共4只）以及年龄相仿的雄性C57BL/6J野生型对照小鼠（WT；共4只），这些小鼠均从日本东京的CLEA公司购买。实验小鼠被单独饲养在经过专业管理的动物实验设施中。
db/db小鼠存在葡萄糖耐量异常、脂肪组织重量增加以及肌肉质量下降的情况
db/db小鼠的体重和随机血糖水平均显著较高（见图1A、B），而通过葡萄糖耐量试验检测到的整体葡萄糖耐量也明显较差（见图1C）。此外，这类小鼠的脂肪组织重量占体重的比例以及脂肪组织的绝对重量也都有所上升（见图1D、E）。胆固醇和甘油三酯等血液指标在db/db小鼠中也显著升高（见图1F）。而慢缩肌Sol和快缩肌Pla的重量则有所下降……
讨论
本研究的结果表明：1）db/db小鼠的慢缩肌Sol和快缩肌Pla中的nNOS蛋白以及 mRNA表达水平均有所下降；2）饱和脂肪酸棕榈酸能够降低nNOS蛋白和 mRNA的表达，而不饱和脂肪酸油酸则没有此效果；3）棕榈酸能够降低nNOS和的表达，并干扰C2C12肌管的形成过程，而高血糖则无此类作用。
在本研究中，db/db小鼠表现出肥胖、葡萄糖耐量异常以及高血脂等症状，同时还存在……
作者贡献
各位作者的职责如下：YT、YH和HT负责研究的构思与设计；YT、NH、MK、AI和AT负责实验操作；YT、NH、MK和YH负责数据分析；YT负责制作图表；YT、YH和HT负责监督实验和数据分析工作；YU、KK、YK、YH和HT共同撰写了论文初稿；所有作者共同参与了结果解读，并对最终稿件进行了审阅和确认。
资金支持与财务披露
本项研究得到了日本学术振兴会的资助，相关项目编号分别为20K19502、24K22281（由YT负责），以及23K27981（由Y.H.负责）。
富城由纪|林望|草野正树|伊藤爱|高野明子|上原良成|川中健太郎|北岛康夫|东木康树|高桥宏和
福冈大学体育健康科学学院，福冈市城南区南久马8-19-1
