高脂肪饮食喂养小鼠组织中二十碳五烯酸衍生物氧化脂质的积累及其对n-6多不饱和脂肪酸衍生物氧化脂质的影响

《The Journal of Nutrition》：Eicosapentaenoic acid derived oxylipin incorporation into tissues of high fat diet fed mice and its consequences for n-6 PUFA derived oxylipins

　　

摘要

背景

二十碳五烯酸（EPA）可通过氧化脂质生物合成改善肥胖症患者的代谢与炎症状况。为研究EPA的作用机制，研究人员给肥胖小鼠注射由EPA衍生的氧化脂质。但目前对于给予此类氧化脂质后，组织中多不饱和脂肪酸衍生的非酯化氧化脂质水平的变化研究尚不充分。

目的

本研究旨在检测高脂饮食小鼠在摄入5-羟基二十碳五烯酸（5-HEPE）和18-羟基二十碳五烯酸（18-HEPE）后的组织中这两种物质的水平。选择这两种物质是因为它们在摄入EPA后会水平上升。

方法

13周大的C57BL/6雄性小鼠被喂食高脂饮食，每隔48小时通过腹腔注射1μg的5-HEPE或18-HEPE，连续两周，最后一次注射在安乐死前1小时。共设置四组进行对比：普通饮食组、高脂饮食组、高脂饮食加5-HEPE组、高脂饮食加18-HEPE组（每组5-8只小鼠）。检测了脂肪/瘦体重、胰岛素/葡萄糖水平以及葡萄糖耐量。通过靶向质谱法测定非酯化氧化脂质的水平，并运用单因素方差分析结合Benjamini-Hochberg校正方法进行统计分析。

结果

与对照组相比，摄入高脂饮食且无论是否添加5-HEPE和18-HEPE的小鼠都存在葡萄糖耐量下降的问题，但并未出现高血糖或高胰岛素血症。与对照组相比，高脂饮食会使多种肺部的5-HEPE和18-HEPE水平降低1.5到3倍（p<0.1）。虽然给予5-HEPE后肺部和脾脏中的这些氧化脂质水平并未上升，但部分肺部n-6多不饱和脂肪酸衍生的氧化脂质水平下降了多达5倍（p<0.1）。而经过5-HEPE处理的动物，脾脏中多不饱和脂肪酸衍生的非酯化氧化脂质水平下降了4到73倍（p<0.1）。此外，给予5-HEPE和18-HEPE后，这些氧化脂质在血浆中的水平上升了多达3倍（p<0.1）。

结论

高脂饮食会降低多种肺部的5-HEPE水平，而5-HEPE对非酯化氧化脂质水平有显著影响。虽然给予5-HEPE和18-HEPE后它们在血液中的水平上升，但在肺部和脾脏中并未上升，这可能是因为这些组织中的这类物质代谢较快，或是由于给药剂量和时机的原因导致其吸收有限。

引言

摄入长链n-3多不饱和脂肪酸，即二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），有助于改善肥胖症的多种表现。1, 2 特别是，长链n-3多不饱和脂肪酸补充剂能够改善肥胖症相关的炎症指标，而炎症正是引发肥胖症诸多并发症的核心因素。³例如，肥胖女性在摄入n-3多不饱和脂肪酸后，血液中的促炎细胞因子水平下降，CD4 T+淋巴细胞中促炎基因的表达也有所降低。⁴此外，n-3多不饱和脂肪酸补充剂还能降低肥胖成年人外周血单核细胞中的促炎标志物表达，减少血液中的促炎细胞因子含量，同时提升抗炎细胞因子的水平。⁵

人们认为n-3多不饱和脂肪酸可通过多种机制发挥抗炎作用。³其中值得关注的是，长链n-3多不饱和脂肪酸如何调控下游氧化脂质的生成——这类氧化脂质是具有生物活性的脂质信号分子，由n-6和n-3多不饱和脂肪酸经过氧化反应产生。⁶多不饱和脂肪酸通过环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LOX）、细胞色素P450（CYP450）等酶类或非酶促反应发生氧化，从而生成多种类型的氧化脂质，包括羟基二十碳五烯酸（HEPEs）、羟基二十二碳六烯酸（HDHAs）以及一些特殊的促炎消退介质（SPMs）。⁷其中一些氧化脂质能够与G蛋白偶联受体结合，从而减轻并消除炎症反应。⁸

多项动物模型研究表明，EPA衍生的氧化脂质能够改善肥胖症患者的炎症状态和葡萄糖代谢。例如，将EPA衍生的氧化脂质5-HEPE、9-HEPE以及17(18)-环氧二十四碳四烯酸（17(18)-EpETE）以70ng/g体重的剂量，每12小时腹腔注射一次，连续4天，可减少高脂饮食小鼠脂肪组织中的巨噬细胞浸润。⁹另一项研究中，肥胖小鼠每隔一天腹腔注射5-HEPE，持续4周（剂量为100 μg/kg体重），结果不仅其胰岛素和葡萄糖耐量得到改善，白色脂肪组织的棕色化程度也有所提高。¹⁰还有研究小组发现，让肥胖小鼠连续2周腹腔注射12(S)-HEPE（剂量为200μg/kg体重），可提升其葡萄糖耐量以及白色脂肪组织中的IL-10水平。¹¹同样，我们之前也发现，给肥胖小鼠连续4天每天腹腔注射1次resolvin E1（剂量为300ng），虽未改变脂肪组织的炎症状态，但能改善其葡萄糖代谢状况。¹²除了肥胖模型之外，也有证据表明5-HEPE和18-HEPE能够在小鼠和人类体外模型中减轻炎症反应，而18-HEPE（以100pg剂量静脉注射，或以1μg剂量腹腔注射，每隔一天交替使用，持续3周；或在暴露前30分钟腹腔注射1μg）能够在体内减轻炎症。^{13, 14, 15, 16, 17, 18, 19}

综上所述，有大量证据表明，腹腔注射EPA衍生的氧化脂质能够改善肥胖小鼠的代谢和/或炎症状况。不过目前仍存在一个重要空白：给予EPA衍生的氧化脂质后，目标组织及血液中的n-3和n-6多不饱和脂肪酸衍生的非酯化氧化脂质水平是否会发生变化。在以往的研究中，只有一组研究者探讨过这个问题，他们发现给予12-HEPE后，30分钟后肥胖小鼠血液中的这类物质水平上升了2.5倍。¹¹为填补这一知识空白，我们给高脂饮食小鼠连续2周腹腔注射5-HEPE和18-HEPE，然后通过靶向质谱法检测了它们在肺部、脾脏及血液中的非酯化氧化脂质水平。我们选择5-HEPE和18-HEPE的原因是，先前的研究已经表明，摄入含有EPA的海洋油后，小鼠体内的这些氧化脂质水平会上升。20, 21, 22

章节节选

动物模型与饲料

所有动物实验均获得了北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理与使用委员会的批准，且符合美国国立卫生研究院关于实验室动物饲养与使用的指南。由于没有相关数据，我们无法预先确定针对EPA衍生氧化脂质给药时的样本量；不过我们之前的研究已经证明，每组6-8只小鼠的组织样本足以用于检测氧化脂质浓度因药物作用而产生的变化。

用EPA衍生氧化脂质处理动物

EPA衍生的氧化脂质5(S)-HEPE（Cayman公司，产品编号32210）和18-HEPE（Cayman公司，产品编号32840）在购买后被储存在-20℃环境中，给药前立即制备。在弱光条件下，将这些氧化脂质稀释在磷酸盐缓冲液（PBS）中，而乙醇作为对照溶剂也同样溶解在PBS中，这一方法已在先前研究中得到验证。¹²稀释后的氧化脂质被储存在琥珀色试管中，并在氮气保护下密封。小鼠接受的是含有1μg（约为28.84 ±2.76

摄入高脂饮食的C57BL6/J小鼠在未给予及给予5-HEPE和18-HEPE时的代谢状况

首先，我们研究了小鼠在摄入高脂饮食后，分别给予安慰剂、5-HEPE或18-HEPE时其代谢状况的变化。无论是否接受治疗，摄入高脂饮食的小鼠体重都明显高于对照组（见图1A）。从脂肪重量来看，所有高脂饮食组小鼠的脂肪重量都显著高于对照组（见图1B）；而从瘦体重来看，高脂饮食组以及摄入18-HEPE的高脂饮食组小鼠的瘦体重也显著高于对照组（见图1C）。在禁食状态下

讨论

本研究的主要目的是确定腹腔注射EPA衍生的氧化脂质5-HEPE和18-HEPE后，是否会导致高脂饮食小鼠不同组织中这类非酯化HEPEs的水平上升。此外，我们还研究了给予这些氧化脂质是否会影响主要由花生四烯酸衍生的非酯化促炎二十烷酸类物质的水平。选择高脂饮食作为实验模型的原因，是我们及其他研究者的前期工作已经表明，EPA衍生的

数据可用性

本文中描述的数据将在获得许可后根据请求提供。

作者利益声明

SR Shaikh是《营养学杂志》的编委会成员。SRS曾获得Metagenics和Organic Technologies公司的资金支持，用于开展关于ω-3脂肪酸的相关研究。

资金支持

本项研究得到了P30DK056350项目（资助者：SRS）、NIH R01ES031378项目（资助者：KMG、SRS）的支持，同时还部分得到了美国国立卫生研究院国家研究资源中心以及韦恩州立大学脂质组学核心设施的资助（项目编号为S10RR027926和S10OD032292）。

致谢

BEB、UC、KG、XBM和SRS共同完成了本篇手稿的撰写工作。BEB和SRS负责实验设计，BEB和UC负责小鼠实验并制作图表，同时进行统计分析。RSG、RV和XMB负责数据收集工作。SRS对整个研究过程负总责。所有作者都阅读并通过了最终版本的手稿。我们还要感谢韦恩州立大学的Krishnarao Maddipati博士在质谱分析方面给予的帮助。所有作者都参与了最终手稿的审阅工作。

Brooke E. Bathon|Umar Chaudhry|Rosemary S. Gray|Ximena M. Bustamante-Marin|Rafia Virk|Kymberly M. Gowdy|Saame Raza Shaikh

美国北卡罗来纳州教堂山市，北卡罗来纳大学教堂山分校吉尔林斯全球公共卫生学院及医学院，营养学系