编辑推荐：
癌症是全球首要死因，2020年近1000万人死于该病。癌症生物标志物的早期诊断对改善预后和减轻全球疾病负担至关重要。然而，传统诊断方法依赖精密仪器、训练有素的人员及复杂工作流程，通常耗时且昂贵。凭借可编程及序列特异性的核酸识别与切割能力，成簇规律间隔短回文重复
癌症是全球首要死因，2020年近1000万人死于该病。癌症生物标志物的早期诊断对改善预后和减轻全球疾病负担至关重要。然而，传统诊断方法依赖精密仪器、训练有素的人员及复杂工作流程，通常耗时且昂贵。凭借可编程及序列特异性的核酸识别与切割能力，成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）-Cas系统已成为疾病诊断的有力工具。其与微流控器件（包括纸基微流控）、电化学及智能手机集成平台等工程手段的融合，进一步提升了成本效益、便携性与自动化水平。本综述阐述了CRISPR-Cas系统的分子机制、现场即时检测（Point-of-Care Testing, POCT）及其兼容技术的最新进展，以及其在癌症早期检测中的应用。研究人员还讨论了关键挑战与未来方向，旨在实现可及且可靠的CRISPR赋能诊断，以改善全球癌症诊疗，并为有效治疗提供潜在解决方案。
1 引言
准确及时地检测疾病生物标志物对改善患者结局和指导治疗策略至关重要。在人类疾病中，癌症仍是全球主要死因，发病率与死亡率上升持续加重医疗系统及经济负担。全球癌症统计报告表明，每年新发超1900万例、死亡近1000万例，由于人口老龄化、生活方式及环境暴露，该负担预计持续增长。因此，恶性肿瘤的早期识别对有效干预和长期健康管理尤为关键，凸显了对有效诊断方法的迫切需求。当前癌症诊断主要依赖医学成像、组织活检和分子生物标志物分析。计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）等成像方法可提供肿瘤可视化与分期，但对早期病变常缺乏灵敏度。组织活检仍是确诊金标准，但其有创、存在操作风险，且受肿瘤可及性与采样异质性限制。液体活检作为微创替代方案，可检测体液中的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）等肿瘤来源生物标志物。由于疾病相关生物标志物丰度低、肿瘤异质性及诊断方法灵敏度有限，癌症早期检测仍是重大临床挑战，亟需兼具高灵敏度、高特异性和广泛可及性的诊断策略。循环肿瘤DNA（ctDNA）和微RNA（miRNAs）等分子生物标志物作为早期检测的微创指标日益受到关注。传统分子诊断技术如细胞培养、抗体免疫分析[如酶联免疫吸附测定（ELISA）]及聚合酶链式反应（PCR）、下一代测序（NGS）等核酸检测方法已展现高灵敏度与特异性，但常需复杂实验室基础设施、昂贵仪器和专业人士，限制了其在资源有限环境中的适用性。在此背景下，CRISPR赋能的现场即时（POC）诊断通过结合可编程分子识别与便携式检测形式提供了补充策略。世界卫生组织（WHO）提出ASSURED标准，后更新为REASSURED框架以纳入实时数据连接等要素。CRISPR系统与Cas核酸酶凭借crRNA引导的序列特异性识别切割，为分子诊断提供新工具，SHERLOCK、DETECTR、HOLMES等平台通过与核酸扩增结合进一步提升灵敏度。微流控与纸基微流控通过紧凑低成本器件扩展POCT潜力，与电化学传感器或智能手机读出的耦合可实现快速实时分析，但临床转化前需严格验证及符合REASSURED原则。
2 CRISPR-Cas系统的分子机制
CRISPR-Cas系统由CRISPR序列及关联Cas核酸酶组成，可实现精准核酸识别与操控。Cas效应蛋白在crRNA引导下选择性结合并切割互补DNA或RNA。除直接切割（顺式切割）外，部分Cas蛋白具有反式切割活性，即在激活后无差别切割附近单链核酸，该特性通过降解标记报告探针实现信号放大。II型Cas9介导原型间隔序列毗邻基序（PAM）依赖的双链DNA（dsDNA）切割；核酸酶失活变体（dCas9）保留结合能力。Cas12（如Cas12a）识别PAM依赖靶DNA后引发单链DNA（ssDNA）报告探针反式切割；Cas13靶向RNA并触发ssRNA非特异性切割，可单核苷酸分辨；Cas14选择性切割ssDNA且无PAM要求，适于单核苷酸区分。
3 CRISPR介导的诊断策略
基于高精度与可编程性，CRISPR-Cas系统成为分子诊断强有力工具，可检测ctDNA体细胞突变、融合基因及miRNA等。策略分为依赖扩增、无扩增及单管一体化三类。表1与表2汇总了代表性平台性能及临床验证情况。
3.1 依赖扩增的CRISPR-Cas诊断
低丰度靶标常需核酸扩增前置。PCR是金标准，但与CRISPR联用受限热循环设备。等温扩增如环介导等温扩增（LAMP）在60–70°C进行，已用于人乳头瘤病毒（HPV）分型；重组酶聚合酶扩增（RPA）在37–42°C实现指数扩增，可与CRISPR/Cas12a一体操作检测结直肠癌外泌体等。滚环扩增（RCA）等其他等温法亦被探索。扩增步骤主导性能，需优化引物、防污染及与CRISPR产物匹配，并应对复杂基质抑制。
3.2 无扩增CRISPR-Cas诊断
为避免扩增相关复杂度，无扩增策略受关注。纳米材料耦合及核酸电路（如CONAN反馈网络）可在37°C达阿摩尔灵敏度；微滴缩减体积提升局部浓度。无扩增Cas12a适配体荧光法测前列腺抗原与ELISA相当。蛋白质工程加速酶动力学及数字量化是未来重点。
3.3 单管CRISPR-Cas诊断
单管将扩增与检测整合，需平衡温度与缓冲兼容性。耐热AapCas12b支持LAMP-CRISPR一体；顺序与并行模式依分层或条件优化区分。ERA-CRISPR/Cas12a检测急性髓系白血病（AML）NPM1突变30分钟达0.01%灵敏；光控crRNA降解将鼻咽癌（NPC）检测缩至10–20分钟。向样本到答案系统转化需封闭提取-扩增-检测及冻干试剂稳健性，并结合人工智能（AI）自动判读。
4 用于POCT的CRISPR赋能平台
4.1 CRISPR赋能微流控与纸基平台
微流控实现亚毫米流体精确操控，数字微流控（DMF） barcode结合CRISPR自催化放大可测唾液癌胚抗原（CEA）及基质金属蛋白酶-1（MMP-1）。双模芯片用引物交换反应（PER）-CRISPR/Cas12a免疫荧光计数PD-L1+ CTC。纸基微流控分析器件（μPADs）靠毛细驱动，侧流层析（LFADs）经Cas反式切割产信号；cc-LFA用双钥匙侵入杂交策略 multiplex检测9种高危HPV，灵敏>90%、特异100%。混合架构将提升定量与可及性，但纸基质变异与试剂稳定性待解。
4.2 CRISPR赋能电化学生物传感器
电化学CRISPR-Cas12a（E-CRISPR）以亚皮摩尔测HPV16；标记法用亚甲基蓝（MB）探针，无标记法监电极界面，纳米材料（还原氧化石墨烯rGO等）增强。其微型化便携，但电极污损及体液电活性物质干扰需抗污涂层与校准。
4.3 CRISPR赋能可穿戴智能手机集成生物传感器
智能手机相机量化Cas12a色原信号；ML模型处理血浆HPV DNA达96.7%灵敏。微针贴片dCas9-石墨烯界面连续监测游离DNA（cfDNA）达1.2 fM；智能织物嵌入RPA-SHERLOCK支持云连接。数据合规（HIPAA、GDPR）、光照校准及生物相容性是推广前提。
5 CRISPR赋能的癌症早期检测
5.1 病毒与miRNAs
HPV是宫颈/头颈癌风险因子，CRISPR分型及ddPCR可达阿摩尔灵敏；EasyCatch限制酶-RPA-Cas12a特异检EGFR突变。miR-17便携电化学发光（ECL）-CRISPR芯片测肝细胞癌，回收率88.7%–103.9%。临床落地需针对热点突变（如KRAS G12、SEPT9甲基化）及防RNA降解。
5.2 蛋白质生物标志物
通过适配体/抗体转导，Cas12a-适配体平台测甲胎蛋白（AFP）低至0.07 fM；CLISA以Cas13a免痕放大测IL-6/VEGF至飞摩尔。蛋白无法扩增，故信号转换设计复杂，但可互补ELISA。
5.3 CTCs与细胞外囊泡
RCA多价适配体网络（MDAN）-Cas12a定量CTC，回收80%–84%；CD63适配体-Cas12a外泌体融合脂质体传感乳腺miR-21吻合PCR。CTC稀有及EV异质需标准化富集。
5.4 小分子与离子
变构转录因子（aTF）平台CaT-SMelor借Cas12a测血尿酸；PICASSO肽自组装扩至血清抗体；结构转换适配体-Cas12a-fDNA传感激ATP/Na+限0.1 mM。代谢物传感受生理浓度窗限制。
5.5 临床转化考量
热点驱动突变（KRAS、EGFR、TP53）及液体活检纳核酸适于CRISPR早筛。应联预扩增或数字分区、多重阵列，并嵌入实验室-NGS流程作初筛或验证，以提升可及性。
6 结论与展望
CRISPR技术为资源受限处癌症诊断提供可编程、模块化平台。Cas9/12/13及耐热AapCas12b、高保真变体扩展应用。微流控疏水腔室及多通道芯片并行分析ctDNA/突变，但气溶胶污染需UDG酶控。完全集成器件须大队列临床验证与冻干稳定。多标志物组合优于单标，机器学习辅助远程监控是趋向。经分子工程、微流控及临床协作，CRISPR-POC诊断具切实转化潜力。
