衰老细胞在核斑上聚集CTCF以指导可变剪接程序

《Nature Aging》：Senescent cells cluster CTCF on nuclear speckles to instruct an alternative splicing program

　　

衰老是正常细胞复制寿命的终点，伴随一系列复杂的分子事件。其中一个事件是CTCF显著重组为衰老诱导的簇（SICCs）。然而，SICCs的分子决定因素、基因组后果和功能目的尚不清楚。在此，研究人员结合三维基因组学、超分辨率成像、DNA追踪和功能分析与建模，以解析SICCs的出现。研究人员发现，在进入衰老时，细胞重新利用核斑的关键组分SRRM2和染色体的“分子胶”BANF1，以聚集CTCF并重构基因组架构。这种以CTCF为中心、参照核斑的重组有助于指导衰老剪接程序，因为破坏SICCs几乎完全逆转了可变剪接模式并延迟了衰老 onset。因此，研究人员揭示了一种范式，即人类细胞将核生化变化转化为结构变化，从而指导剪接选择以 commit 到衰老命运。

**论文解读：衰老细胞在核斑上聚集CTCF以指导可变剪接程序**

**研究背景与问题**

细胞衰老是正常细胞复制寿命的终点，伴随一系列分子事件，其中包括CCCTC结合因子（CTCF）显著重组为衰老诱导的簇（SICCs）。前期研究已发现SICCs的形成与高迁移率族蛋白B2（HMGB2）的核耗竭有关，但SICCs的分子决定因素、HMGB2耗竭如何触发其形成，以及SICCs的功能目的仍不清楚。此外，核斑作为动态核凝聚体，富含聚腺苷酸RNA和剪接因子，已被证明与应激反应相关，但其在细胞状态转变（如衰老）中的作用尚未明确。本研究旨在解答上述三个核心问题，揭示SICCs形成的分子机制及其对衰老进程的调控作用。

**研究内容与结论**

研究人员利用inflachromene（ICM）诱导的均质衰老IMR90胎儿肺成纤维细胞模型，综合运用三维基因组学、超分辨率成像、DNA追踪、功能分析及分子动力学模拟，系统解析了SICCs的涌现机制。研究发现，当细胞进入衰老时，细胞重新利用核斑关键组分SRRM2（丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白2）和染色体“分子胶”BANF1（屏障自整合因子1），以聚集CTCF并重构基因组架构。这种以CTCF为中心、参照核斑的重组有助于指导衰老剪接程序，因为破坏SICCs几乎完全逆转了可变剪接模式并延迟了衰老 onset。该研究揭示了人类细胞将核生化变化转化为结构变化，从而指导剪接选择以 commit 到衰老命运的范式，论文发表在《Nature Aging》。

**主要技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：1) 免疫共沉淀结合质谱（Co-IP-MS）鉴定衰老特异性CTCF互作蛋白；2) 染色质免疫沉淀测序（ChIPmentation）和CUT&Tag技术绘制SON、HMGB2和CTCF的全基因组结合谱；3) 超分辨率受激发射损耗显微镜（STED）观察SICCs与核斑的共定位关系；4) 基于寡核苷酸FISH的DNA追踪技术（LoopTrace）在单细胞水平追踪染色质折叠；5) 微交联（Micro-C）技术分析全基因组染色质环动态；6) 分子动力学模拟构建CTCF-染色质-核斑相互作用模型；7) RNA测序（RNA-seq）结合Whippet算法分析可变剪接事件；8) 简化交联免疫沉淀（sCLIP）和抗坏血酸过氧化物酶邻近标记测序（APEX-seq）鉴定RNA结合蛋白靶标。样本来源包括IMR90胎儿肺成纤维细胞、HUVEC脐静脉内皮细胞，以及年轻（5-6岁）和年老（89-96岁）供体皮肤成纤维细胞（GM00038、AG05247）和全血RNA-seq数据。

**研究结果**

**CTCF在衰老中显示特异性蛋白相互作用**
通过Co-IP-MS在ICM诱导衰老的IMR90细胞中鉴定出10种与CTCF显著增强结合的蛋白，包括SRRM2、BANF1、ATXN2、SQSTM1等。这些蛋白多具有中等至高的无序结构域，且SICCs可被1,6-己二醇快速溶解，表明SICCs具备凝聚体特性。

**BANF1是SICC形成所必需但不充分**
siRNA敲低BANF1使衰老细胞中SICCs阳性细胞数减少超过3倍，在复制性衰老细胞中也得到验证。然而，在增殖细胞中过表达BANF1-Venus未能诱导SICCs，提示BANF1是必要但不充分因子。

**通过SRRM2的核斑关联指导SICC形成**
免疫荧光显示SICCs与核斑标志物SC-35强烈共定位，且药物处理改变核斑形态时SICCs随之重塑。STED超分辨率成像显示SICCs呈颗粒状，CTCF信号峰值与SC-35信号核心偏移。SRRM2敲低完全消除SICCs，而过表达SRRM2的RNA结合域（RBD）足以在增殖细胞中诱导CTCF在核斑上聚集，表明SRRM2是SICCs形成充分必要条件。RNA降解实验和Zn²⁺操作提示CTCF-DNA与CTCF-RNA相互作用间的复杂平衡。

**HMGB2与核斑组分结合并阻止CTCF聚集**
HMGB2的酸性尾部（而非box A结构域）过表达足以阻止SICCs形成，且Co-IP显示该尾部与SRRM2、BANF1等核斑组分相互作用。ChIPmentation揭示HMGB2和SON（核斑另一核心组分）广泛结合于A1亚区室，与核斑邻近。分子动力学模拟显示，HMGB2去除后CTCF聚类增加，而SRRM2去除则阻止聚类，支持HMGB2与CTCF竞争核斑关联的拮抗关系。

**衰老中CTCF为中心的3D基因组重组**
Micro-C数据显示衰老中新增约8,750个更长的CTCF锚定环，这些环的锚点处CTCF占据和绝缘性增强。1,6-己二醇处理溶解SICCs后，衰老特异性环强度显著降低。Chrom3D建模表明CTCF富集TADs在衰老中空间聚类增加，并与核斑邻近。

**CTCF聚类在单细胞水平重组染色质**
LoopTrace对chr.2和chr.5区域的DNA追踪证实，衰老细胞中染色质形成更多嵌套环结构，与核斑关联增强，且染色质总轮廓长度增加，与核小体占据降低一致。

**SICC形成是衰老剪接模式所必需**
RNA-seq分析发现ICM处理诱导976个异构体转换，主要涉及可变转录起始和终止位点以及盒式外显子跳跃。SRRM2、BANF1或CTCF敲低几乎完全逆转这些衰老诱导的剪接事件（ρ<-0.70），且逆转事件多位于A1亚区室。这些剪接模式与衰老相关GO term（如细胞周期调控、染色体组织）相关，并在复制性衰老IMR90和HUVEC中重现。

**HMGB2结合衰老中可变剪接的核斑相关mRNA**
sCLIP鉴定出287个HMGB2结合的mRNA在衰老中发生可变剪接，且APEX-seq显示这些mRNA在衰老中从核斑耗竭。CTCF eCLIP数据仅检测到少量剪接mRNA，进一步支持SICCs通过核斑近端调控剪接。

**SICC相关剪接模式与衰老和衰老 commit 相关**
年轻和年老供体皮肤成纤维细胞中，年老细胞显示SICC样表型增加。RNA-seq分析显示年老皮肤活检和全血中>66%的剪接变化与衰老IMR90或HUVEC共享，且与衰老相关GO term正相关。SICC破坏（通过敲低SRRM2、BANF1或CTCF）使ICM处理或复制性衰老细胞继续增殖，延迟衰老 onset。

**总结与讨论**

本研究揭示了SICCs形成于核斑上的分子机制：HMGB2核耗竭后，CTCF与SRRM2和BANF1协同作用，在核斑表面形成聚集，引发大规模3D基因组重组，进而指导可变剪接程序以促进衰老 commit。讨论部分指出，HMGB2和CTCF对核斑关联的竞争性拮抗是SICCs涌现的关键，而全局RNA输出减少可能通过降低RNA对CTCF-核斑相互作用的“表面活性剂”效应而促进聚集。SICCs通过将特定基因座锚定在核斑附近，改变其剪接命运（特别是“平坦”型外显子），从而实施衰老剪接程序。研究结论翻译如下：总之，研究人员提供了将大规模和精细尺度的三维基因组重组与细胞衰老的剪接程序实施联系起来的证据。这不仅代表了核结构与基因表达调控（超越转录）相互作用的范式，也可能为衰老调控提供入口。由于衰老组织中衰老细胞负荷与健康寿命和寿命延长有因果关系，并且在时序老化细胞中也检测到许多衰老相关剪接变化，干扰核斑和SICC生理学可能提供延迟衰老或减轻其部分影响的手段。