一种利用时域核磁共振技术对不同果胶生产方法进行比较研究的多元分析策略

《Microchemical Journal》：A multivariate analysis strategy for a comparative study of pectin production methods using time–domain NMR

　　

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  提出了一种用于果胶分析的新的TD–NMR多变量分析方法。
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  与传统的CPMG分析相比，该分析方法能更好地对样本进行聚类。
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  通过MCR–ALS进行的频谱分解在区分能力上优于CPMG方法。
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  成功区分出了具有不同分子移动性的水合区域。

引言

果胶是一种结构复杂的多糖，也是植物细胞壁中间层的主要成分[1]。其骨架主要由通过(1?→?4)糖苷键连接的α-D-半乳糖醛酸残基的线性链构成，其中还分布着带有中性糖侧链的高度分支的鼠李糖半乳聚糖区域，这些侧链包括阿拉伯糖和半乳糖[2]、[3]。商业用果胶主要从柑橘皮和苹果渣中提取[4]；不过，人们越来越关注其他来源，尤其是甜菜浆(SBP)。SBP是糖业的主要副产品，欧洲每年产生的量超过2000万吨[5]。这些残留生物质中含有大量的多糖（22–24%纤维素，23–24%半纤维素，15–25%果胶），是提取具有工业价值的生物活性化合物的优质原料[6]。

果胶的提取通常是在高温下（约80?°C）使用盐酸或硝酸进行酸水解，之后再通过膜过滤纯化并经过酒精沉淀处理[7]、[8]。然而，最终产品的产量和性质（如分支程度或链的线性度）会受到提取、纯化和沉淀条件的显著影响。

由于果胶生产过程中的不确定性，需要一些能够评估其结构异质性的分析技术。滴定法和HPLC已被用于测定半乳糖醛酸含量、酯化程度、单糖组成以及果胶骨架的变化[9]。FTIR光谱作为一种快速且无损的分析技术，可用来检测酯化和非酯化的羧基[10]。此外，高分辨率NMR则能提供关于酯化和乙酰化模式的更详细的结构信息[11]。不过，这些研究主要侧重于组成或官能团信息，对于质子移动性或水合区域的了解较为有限。在此背景下，时域核磁共振(TD–NMR)作为一种快速且无损的分析技术，被用于复杂分子系统的分析[12]。与传统的高分辨率NMR相比，TD–NMR成本更低，无需样品预处理或使用氘代溶剂，重复性高，可直接应用于固体、半固体或液体样品[13]。通过测量纵向(T₁)或横向(T₂)弛豫时间，TD–NMR能够为了解分子移动性和分子间相互作用提供重要信息[14]。这些优点使其被广泛应用于各种食品的质量控制，包括乳制品、肉类、水果、奶酪以及淀粉等[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。

将TD–NMR测量结果与多变量分析相结合，为提取相关信息以及进行定性和定量评估带来了巨大潜力[20]。大多数应用都是通过主成分分析(PCA)、k最近邻(k?NN)、偏最小二乘判别分析(PLS–DA)、软独立建模类比法(SIMCA)、数据驱动SIMCA(DD-SIMCA)、偏最小二乘回归(PLS–R)和支持向量机(SVM)等方法来分析弛豫曲线。这些模型在探索性分析、分类/鉴别以及量化任务中都表现良好，应用范围包括工业番茄品种的选择、牛奶中甲醛的检测、葡萄花汁中的掺假问题以及燃料中柴油含量的监测等[21]、[22]、[23]、[24]。

在果胶相关研究中，多变量分析也被主要用于区分或量化甲酯化程度，以及预测产量和质量[25]、[26]、[27]；不过，针对不同提取和纯化工艺所得果胶产品的区分研究则相对较少。另外，诸如多变量曲线分解-交替最小二乘法(MCR–ALS)这样的先进分解技术，能为解析复杂响应提供有力工具。通过受限双线性建模，MCR–ALS能够将混合信号分解为各组成成分的单独贡献[28]。尽管MCR–ALS已广泛应用于FTIR或HPLC-DAD等多种分析技术，但其在TD–NMR中的应用仍较为少见[29]。

在之前的研究中，我们使用了TD–NMR和FTIR光谱来研究提取和纯化条件如何影响甜菜果胶的结构和动态特性，重点关注了分子移动性、自旋扩散以及官能团差异[30]。不过，我们的工作主要是对样本的物理化学特性进行解释，并未探讨是否可以通过多变量分析区分结构极为相似的果胶样品。因此，本研究提出了一种多变量分析策略，用于处理通过饱和恢复实验并采用MSE序列(SR–MSE)获得的Magic Sandwich Echo (MSE)信号，根据饱和脉冲与MSE序列之间的恢复延迟(τ)来评估结构相似的果胶样品是否存在可区分的方法依赖型结构特征。作为初步步骤，首先将SR–MSE信号转换为频域，得到¹H NMR光谱，然后通过MCR–ALS对其进行分析。随后，通过PCA、MCR–ALS和线性判别分析(LDA)，将该策略的性能与传统的Carr–Purcell–Meiboom–Gill (CPMG)弛豫曲线进行了对比评估。

章节节选

果胶样品

共制备了五种来自SBP的粉状果胶样品，这些样品由土耳其凯塞里的Kayseri ?eker工厂提供。为了提高果胶的溶解度，采用高温酸性条件（pH?2.0，80–90?°C）进行提取。提取液通过机械压榨与剩余的果肉分离，之后再经过不同的纯化处理：超滤(UF)、异丙醇(IPA)处理，以及UF与IPA联合处理。

IPA沉淀法被作为一种常规的纯化手段

TD–NMR弛豫响应

图2展示了这些果胶样品的CPMG弛豫曲线以及¹H NMR光谱。CPMG曲线（图2a）显示出了信号衰减方面的整体差异，其中SBPP与MD30之间的差异最为明显。SBPP需要双指数拟合，而所有其他果胶样品则更适合用三指数拟合来描述。拟合得到的T₂值汇总在表2中。这种响应特征与多糖的结构异质性一致，因为不同的质子环境会呈现出

结论

本研究通过将SR–MSE信号转换为¹H NMR光谱，再利用MCR–ALS进行频谱分解，提升了TD–NMR在分析结构相似果胶样品时的能力。虽然通过PCA、MCR–ALS和LDA分析后，CPMG弛豫曲线在区分不同果胶样品和二元混合物方面效果有限，但所提出的策略却能有效区分这些果胶样品以及其中的二元混合物。此外，

CRediT作者贡献说明

Cristian A. Fuentes：撰写——初稿、方法学、研究实施、正式分析、概念构建。Esmanur Ilhan：撰写——审阅与编辑、方法学、研究实施、正式分析。Mariia Ivanova：撰写——审阅与编辑、方法学、研究实施、正式分析。Macarena Rojas-Rioseco：撰写——审阅与编辑、方法学、正式分析。Pamela Sanhueza-Novoa：撰写——审阅与编辑、方法学、正式分析。Aylin ?zgür G?ksu：撰写——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的MSCA RISE项目（授权号#101008228）以及智利的ANID国家博士奖学金[21240532]和FONDECYT基金[1251201]的支持。作者们还要感谢Kayser Sugar公司提供了所需的样品。

Cristian A. Fuentes|Esmanur Ilhan|Mariia Ivanova|Macarena Rojas-Rioseco|Pamela Sanhueza-Novoa|Aylin ?zgür G?ksu|Mecit Halil ?ztop|Leonid Grunin|Rosario del P. Castillo