《Journal of Neurochemistry》：Understanding Human Cortical Expansion Using Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Organoids: Insights Into Progenitor Evolution and Diversity
人类大脑的进化是高级认知功能的基础。特别是大脑皮层（cerebral cortex），作为大脑的最外层，已经快速进化到包含相对于大脑其他部分不成比例的大量神经元。这种扩张在很大程度上归因于神经前体细胞（neural precursors, NPs）池的扩大和多样化，这些细胞增殖并分化为大脑的神经元和胶质细胞。人类大脑皮层如何进化仍然是一个活跃的研究领域。随着多能干细胞（pluripotent stem cell, PSC）和脑类器官（brain organoids）技术的出现，人类、小鼠和非人灵长类之间的比较基因组研究已经识别出神经发育过程中人类特异性基因或通路。这些模型的实用性依赖于脑类器官在体内观察到的多种神经和胶质细胞类型中保持细胞结构（cytoarchitecture）和物种特异性发育轨迹的能力。本综述将讨论脑类器官如何再现皮层发育过程中种间差异的各个方面，特别是神经前体细胞扩张（neural precursor expansion）、神经发生（neurogenesis）和胶质发生（gliogenesis），以及这些模型如何改进以实现对人类大脑进化的更深理解。揭示大脑扩张中跨物种差异的细胞和分子机制，也可能为神经发育疾病，特别是那些影响大脑尺寸的疾病，提供关键见解。
1 引言
人类大脑的进化性扩张，特别是大脑皮层，被认为是独特智力能力的重要方面。人类皮层包含的神经元数量是小鼠皮层的1200倍，是恒河猴皮层的10倍。重要的是，与其他哺乳动物相比，人类表现出不成比例的高皮层-皮层下神经元比率，这种显著增加不能仅通过体型差异来解释。皮层神经元数量的增加支撑着许多复杂的认知功能，如语言、抽象思维和工作记忆。在细胞层面，这种数量增加主要由人类皮层神经干细胞和祖细胞（统称为神经前体细胞（neural precursors, NPs））独特的增殖和分化行为驱动。这导致了胚胎NP池的大规模扩增，这些NP产生了构成出生后大脑的大部分神经元和胶质细胞。尽管对理解人类皮层NP群体扩增的关注很多，但精确的细胞和分子机制仍有待充分阐明。
研究人员出色的认知能力可能伴随着生物学代价。人类对复杂的神经发育和精神疾病（如自闭症谱系障碍和精神分裂症）具有不成比例的易感性。越来越多的基因组证据表明，这种脆弱性与研究人员的进化历史交织在一起：许多使皮层扩张成为可能的遗传创新存在于同一基因座，其中致病突变可能破坏正常的大脑发育并导致疾病。然而，将人类特异性进化变化与神经系统疾病易感性联系起来的机制仍然知之甚少，部分原因是直到最近，在物种比较背景下研究这些机制所需的实验系统在很大程度上不可用。
长期以来，研究支配人类大脑进化的细胞和分子机制受到伦理和物理上无法获取人类和非人灵长类胎儿组织，以及缺乏能够保持原生物种特异性发育程序的模型的瓶颈。多能干细胞（pluripotent stem cell, PSC）技术和三维类器官平台的出现改变了这一领域，使得能够从任何可衍生PSC的物种生成活体神经组织，并允许在体外直接进行遗传操作和实时观察人类特异性发育事件。在本综述中，研究人员首先描述了类器官研究旨在模拟的皮层发育中跨物种的关键差异。接下来，研究人员评估了当前类器官系统在多大程度上再现了这些差异，包括其细胞结构、细胞多样性和发育时间。然后，研究人员总结了基于类器官的方法如何揭示代谢、细胞信号传导、表观遗传和转录调控以及细胞结构方面的人类特异性机制。最后，研究人员强调了新兴的实验策略，并讨论了非皮层脑区，这将加深研究人员对人类大脑扩张及其与神经系统疾病关系的机制理解。
2 人类皮层发育中的物种特异性特征
尽管发育时间和最终大脑尺寸存在显著差异，但神经发育的早期阶段在哺乳动物物种（包括啮齿动物和灵长类）中高度保守。在人类早期胚胎发生过程中，源自外胚层组织的神经管大约在妊娠周（gestational week, GW）4关闭。神经管最初由围绕空心腔的假复层神经上皮组成，该腔后来形成大脑的脑室系统。在包括小鼠在内的哺乳动物物种中观察到类似的神经上皮组织，反映了早期皮层模式下的保守发育程序。神经上皮细胞最初进行对称增殖分裂以扩大和增厚神经上皮，然后转向不对称分裂以产生放射状胶质细胞并启动神经发生。在人类中，这种转变发生在相对延长的发育时间尺度上，并伴随着逐渐出现的扩增的生发区，这支持了祖细胞扩增和皮层生长增加。
脑室带（ventricular zone, VZ）代表发育中皮层的主要生发层，在哺乳动物物种中广泛保守。在VZ内，源自神经上皮细胞的脑室放射状胶质细胞（ventricular radial glia, vRG）和中间祖细胞（intermediate progenitor cells, IPCs）作为顶端祖细胞，因为它们的顶端突起接触脑室表面。vRG，也称为顶端放射状胶质细胞，是最早从神经上皮细胞产生的放射状胶质细胞群体之一，表现出特征性的双极形态，突起向脑室表面和软脑膜表面延伸。这些细胞既为神经元迁移提供结构支架，也作为增殖祖细胞群体直接或间接产生神经元。尽管VZ的整体结构和功能在啮齿动物和灵长类之间高度保守，但物种差异通过增殖动态、发育时间和下游祖细胞群体的产生变化而出现，这些最终导致皮层扩张。
与相对保守的VZ相比，室下带（subventricular zone, SVZ）在灵长类，特别是在人类中，表现出显著的进化扩张和增加的组织复杂性。SVZ可细分为内SVZ（inner SVZ, iSVZ）和外SVZ（outer SVZ, oSVZ），每个包含重叠和不同的NP群体，包括IPCs和外放射状胶质细胞（outer radial glia, oRG）。SVZ内的IPCs主要是多极基底祖细胞，通常缺乏顶端附着，并在神经元分化前经历几轮增殖分裂。在发育中的人类皮层中已识别出扩增的IPC亚型，表明IPC异质性增加是灵长类皮层进化的重要特征。
虽然啮齿动物中存在基本的SVZ，但灵长类拥有显著扩大的SVZ和一个突出的富含oRG的oSVZ，oRG是一种与皮层扩张和折叠密切相关的祖细胞群体。oRG在发育中的人类皮层中大约在GW 13出现，并显示出几个独特的细胞特征，将其与其他NP群体区分开来，最显著的是有丝分裂体移位（mitotic somal translocation），其中细胞体在细胞分裂前立即沿基底突起快速移位。人类oRG还表现出广泛的增殖和神经发生能力，在妊娠中期对神经元产生做出贡献，特别是晚期出生的上层神经元。单细胞转录组研究进一步识别了oRG群体内的分子特化，包括可能支持oSVZ NP生态位维持的生长因子和细胞外基质信号通路的富集。除了神经发生，oRG还参与胶质发生，在皮层发生后期产生星形胶质细胞和少突胶质细胞。
尽管同源NP群体存在于哺乳动物中，但它们的丰度、分子特性和神经发生行为存在显著的物种特异性差异。比较研究表明，与无脑回物种如啮齿动物相比，有脑回物种如人类和猕猴通常拥有扩增的oRG群体，支持oRG丰度与皮层扩张和脑回化之间的强烈关联。然而，这种关系并非绝对。例如，普通狨猴拥有相对平滑的皮层，尽管含有大量的oRG群体，这表明oRG丰度本身不足以引起脑回化。与这一观点一致，直接的跨物种比较揭示了oRG生物学的重要定性差异。虽然已在无脑回的鼠皮层中识别出罕见的oRG样细胞，但与人类oRG相比，它们经历更直接的神经发生。类似地，虽然雪貂拥有丰富的oRG群体，并广泛用作皮层扩张模型，但人类oRG显示出更长的有丝分裂体移位距离和更大的产生IPC的倾向。在有脑回物种内部也观察到额外的异质性，包括在雪貂发育皮层中识别出HOPX
- oRG群体，其自我更新能力相对于HOPX
+ oRG降低。推测的HOPX
- oRG也已在人类皮层类器官中报道，但它们在发育中人类皮层中的存在和功能意义仍有待探索。总之，这些发现表明，皮层的进化扩张可能不仅取决于oRG丰度，还取决于祖细胞行为、增殖能力和谱系潜能的物种特异性适应。
皮层神经元输出的物种差异不仅由祖细胞丰度和行为塑造，还由发育时间的进化改变塑造。尽管皮层发生的大致顺序在哺乳动物中广泛保守，但相对于啮齿动物和非人灵长类，人类表现出显著延长（bradychronic）的神经发育。在胎儿皮层发生过程中，NP扩张和神经发生阶段在人类中均比猕猴和小鼠显著延长，从而增加了NP增殖和神经元产生的时间。因此，发育窗口的异时性扩张被认为是人类皮层尺寸和复杂性增加的主要贡献因素。这种较慢的发育速度持续到胎儿阶段之后。相对于猕猴，人类大脑在出生时明显不成熟，仅达到最大成年体积的25%–30%。出生后的成熟在人类中也延长，髓鞘形成持续到生命的第三个十年，突触修剪发生在比猕猴长得多的时间尺度上。总之，这些发现表明，产前和产后阶段的延长发育时间代表了人类大脑发育的关键进化特征。
3 类器官作为体外研究皮层发育的模型
诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）技术的发展通过提供对原本无法获得的发育阶段和物种特异性细胞程序的实验访问，改变了人类神经发育和进化的研究。由于胎儿脑组织难以跨物种获取，特别是在早期皮层发生期间，PSC系统提供了一个可扩展且遗传可操作的平台，用于在体外模拟皮层发育。此外，PSC可以使用基于CRISPR的基因组工程方法轻松操作，允许直接探究候选进化机制和人类特异性遗传程序。在过去十年中，研究人员开发了二维（2D）和三维（3D）神经分化系统，能够生成区域特异性神经细胞类型，包括发育中皮层的那些。重要的是，这些体外模型再现了人类皮层发生的几个标志性特征，包括扩增的祖细胞带、增加的祖细胞异质性、丰富的oRG和延长的发育时间。因此，PSC衍生的神经培养物已成为研究人类皮层扩张的细胞和分子机制的有力比较系统。
在3D皮层类器官系统开发之前，皮层发生的早期体外建模主要依赖于2D单层分化方法，这些方法建立了当前类器官方案中使用的许多基础模式原则。通过双SMAD抑制进行神经诱导有效地将PSC导向神经外胚层命运，产生自组织成极化玫瑰花结样结构（类似于胎儿脑室带）的皮层NPs。这些NPs随后可以通过发育信号通路的分阶段调节和有丝分裂原撤除分化为主要的皮层细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。还开发了针对中胚层衍生的小胶质细胞的不同分化范式。重要的是，尽管相对简单，2D皮层培养保留了皮层发生的关键时间特征，包括首先深层神经元依次产生，然后是上层神经元和胶质群体。然而，由于这些系统缺乏高阶组织组织和扩增的生发带结构，它们不完全模拟与人类皮层扩张相关的许多细胞和空间特征。
3D脑类器官技术已成为一个强大的平台，用于在体外模拟人类皮层发生的空间和时间复杂性。与2D单层培养不同，类器官更有效地再现了发育中皮层的祖细胞组织和细胞多样性，使其特别适合研究跨物种皮层扩张的机制。早期从PSC生成的自组织皮层类器官证明了类似于发育中大脑皮层的神经上皮结构的自发形成，而随后加入细胞外基质支持和发育模式策略使得能够生成越来越复杂和可重复的皮层组织。这些类器官形成脑室样玫瑰花结结构，包含VZ样和SVZ样生发带，包括一个富含oRG的独特oSVZ样隔室。重要的是，类器官保留了人类皮层发生特征性的由内向外顺序产生皮层层次、延长的神经发生和后期胶质发生，这些特征在更简单的2D系统中难以实现。
皮层类器官的细胞和分子保真度已通过转录组、表观基因组、蛋白质组和空间分析等方法得到广泛验证，显示出与胎儿皮层发育的强烈对应。关键的是，皮层类器官系统现在可以从多个哺乳动物物种生成，包括小鼠、猕猴、黑猩猩、大猩猩、猩猩和人类的PSC，使得能够在实验可访问系统中直接比较分析物种特异性发育程序。许多这些比较类器官研究已在转录组或表观遗传学上进行了表征，揭示了在体外保留的物种特异性发育时间。例如，人类皮层NPs比猕猴NPs更晚从深层神经元向上层神经元神经发生转变，而单细胞转录组分析显示，相对于黑猩猩和猕猴类器官，人类中神经发生向胶质发生的转变延迟。此外，与黑猩猩NPs相比，人类NPs表现出延长的有丝分裂进程，表明细胞周期动力学的物种特异性差异可能有助于人类皮层扩张。总之，这些发现确立了皮层类器官作为解剖人类大脑进化背后细胞、时间和分子机制的独特强大实验平台。
4 从类器官研究获得的人类皮层扩张见解
比较类器官研究开始揭示有助于人类皮层扩张的细胞和分子程序。皮层尺寸和复杂性的增加似乎并非源于单一的进化变化，而是涉及多个过程的协调改变，包括代谢、基因调控和信号传导活动。在类器官系统中对人类特异性遗传变异的功能探究提供了关于这些通路如何共同影响NP行为和神经元产生的重要机制性见解。在以下部分中，研究人员重点介绍了代表性的类器官研究，阐明了物种特异性发育程序如何促进扩增的神经发生和延长的皮层发生。
4.1 代谢
越来越多的证据表明，代谢调节，特别是线粒体功能，在协调人类皮层发生过程中的发育时间和NP扩张中发挥核心作用。线粒体动态已成为祖细胞行为的重要调节因子，影响NPs是进行自我更新还是承诺神经元分化。Iwata等人证明，有丝分裂后新生的神经元在有丝分裂后立即获得一个短暂的可塑性窗口，在此期间，线粒体融合增加促进自我更新，而线粒体分裂增强则使细胞偏向神经元分化。有趣的是，相对于小鼠祖细胞，人类祖细胞中可塑性窗口延长，可能为人类NPs提供更多自我更新和祖细胞池扩增的机会。除了NP命运决定，线粒体代谢还控制神经元成熟的速率。小鼠皮层神经元，比人类神经元成熟更快，表现出更高的线粒体代谢活性，表明较慢的代谢进程可能有助于人类皮层发生特征性的延长发育时间。
几种与皮层扩张相关的人类特异性遗传改变似乎汇聚在线粒体和代谢通路上。ARHGAP11B是人类特异性部分复制ARHGAP11A的产物，在从黑猩猩谱系分离后出现，通过人类基因特有的剪接位点突变促进NP增殖。ARHGAP11B在SVZ祖细胞中特异性表达，并通过诱导线粒体代谢程序部分增强NP扩张。与其在人类皮层扩张中提出的作用一致，ARHGAP11B在黑猩猩皮层类器官中的异位表达增加了NP丰度。人类特异性结构基因组变异也与皮层发生的代谢调节相关。Johansson等人识别了KRAB锌指蛋白ZNF558下游串联重复区域的物种特异性变异，其中人类重复序列的缩短允许NP特异性ZNF558表达，这在黑猩猩中未观察到。ZNF558抑制线粒体自噬调节因子SPATA18，CRISPR干扰（CRISPRi）介导的ZNF558抑制减少了人类皮层类器官的大小，暗示线粒体质量控制通路参与人类皮层生长。
脂质代谢同样已成为祖细胞行为和发育节奏的重要调节因子。相对于尼安德特人中保守的古老TKTL1变体，人类TKTL1通过促进脂肪酸合成增加oRG丰度和上层神经元发生，可能支持oRG特征性的广泛细胞过程。最近，比较类器官研究表明，与人类相比，小鼠NPs中线粒体脂肪酸氧化增加，导致发育节奏的物种差异。实验诱导线粒体脂肪酸氧化加速了人类皮层类器官的发育进程，进一步支持了代谢状态、异时性发育和皮层扩张之间的机制联系。总之，这些发现表明，代谢重编程可能代表人类皮层发育实现延长的祖细胞维持、延迟成熟和增加的神经元输出的基本机制。
4.2 表观遗传和转录调控
人类皮层发生背后的许多进化差异被认为源于基因调控的改变，而非蛋白质编码序列的大规模变化。人类加速区域（human accelerated regions, HARs）是在整个脊椎动物进化中高度保守但在人类谱系中积累了异常多核苷酸替换的基因组序列。由于许多HARs位于基因组的非编码区域，它们被认为作为发育调控元件，在皮层发育过程中调节基因表达。人类和黑猩猩PSC衍生NPs的比较表观基因组分析识别了许多与活性增强子特征和开放染色质状态相关的HARs，表明皮层发生过程中调控活性的广泛进化分歧。与这一观点一致，大规模平行报告基因分析表明，人类和黑猩猩直系同源HAR序列在NPs中经常表现出差异增强子活性。进一步支持HARs在皮层扩张中作用的功能证据来自基于CRISPR的扰动筛选，其中几个假定的皮层增强子的破坏减少了人类NP丰度。总之，这些发现表明，增强子活性的进化重连可能有助于祖细胞增殖和发育时间的物种特异性调节。
除了对调控进化进行广泛比较分析外，几项研究还对与皮层扩张相关的个体人类特异性调控机制进行了功能表征。TBC1D3是一个通过染色体17上片段复制产生的类人猿特异性基因，促进小鼠皮层中NP增殖和oRG样群体的扩张。机制上，TBC1D3抑制组蛋白甲基转移酶G9a，将染色质调控与祖细胞维持联系起来。在人类皮层类器官中过表达TBC1D3增强NP增殖，而敲低则促进过早的神经元分化。人类HAR1984提供了影响皮层发生的物种特异性调控进化的另一个例子。与黑猩猩直系同源序列相比，人类HAR1984表现出更大的增强子活性，并增加黑猩猩皮层类器官中放射状胶质细胞和神经元的丰度。机制上，人类HAR1984促进与靶基因ETV5和TRA2B的染色体相互作用，从而升高它们的表达，而转录因子ETV5的招募通过正反馈机制进一步放大ETV5表达。类似地，最近被识别为在人类（而非小鼠）放射状胶质细胞中特异性表达的转录因子IRF1上调JUNB和细胞周期进程基因，提供了支持祖细胞扩张的人类特异性转录调控的另一个例子。总之，这些研究说明了染色质结构和基因调控活性的进化修饰如何微调发育基因表达程序，以促进人类中延长的祖细胞扩张和增加的皮层复杂性。
4.3 细胞信号通路
比较类器官研究表明，人类皮层扩张与保守发育信号通路的物种特异性调节相关。一些人类特异性遗传改变似乎通过改变皮层发生过程中的NOTCH和WNT通路活性来增强祖细胞维持并延迟神经元分化。NOTCH2NL是一个人类特异性基因家族，由NOTCH2的部分复制产生的四个旁系同源物组成。NOTCH2NL基因在发育中的人类皮层中表现出NP偏向性表达，并且NOTCH2NL过表达增加人类NPs在体外的自我更新能力。功能研究进一步证明，NOTCH2NL的异位表达延迟神经元分化并增加小鼠皮层类器官的大小，而NOTCH2NL缺失导致过早的神经元分化并减少人类皮层类器官的大小，通过延长NP维持和延伸发育时间巩固了NOTCH2NL在人类皮层扩张中的作用。
影响WNT信号的人类特异性调控变化同样与皮层扩张相关。人类加速调控增强子HARE5位于FZD8附近，FZD8编码参与经典WNT信号通路的受体。比较研究表明，在小鼠和PSC衍生神经培养物中，人类HARE5序列比黑猩猩直系同源序列更强烈地促进NP增殖。此外，携带人类HARE5的小鼠具有更大的皮层和增加的兴奋性神经元产生，支持了发育信号通路的进化修饰可以直接影响祖细胞扩张和皮层神经元输出的观点。总之，这些研究说明了人类特异性遗传和调控变化如何微调保守的信号网络，以促进持续的神经发生和增加的皮层复杂性。
4.4 细胞结构和形态
比较类器官研究进一步表明，祖细胞结构和形态的物种特异性差异有助于人类皮层发生过程中延长的扩张。在早期皮层发育过程中，神经上皮细胞经历向较少增殖状态的形态转变，这种转变在人类中发生得比其他类人猿更晚，从而延长了早期NPs的增殖阶段。影响亚细胞结构的人类特异性遗传变化也与皮层扩张相关。CROCCP2是纤毛基因CROCC的人类特异性部分复制，通过缩短初级纤毛和增强mTOR信号促进SVZ内基底祖细胞的增殖。与代谢、转录和信号适应一起，祖细胞形态和细胞结构的进化修饰代表了人类皮层发生实现延长的祖细胞维持和增加的神经元输出的另一种机制。
5 局限性和未来展望
5.1 当前比较类器官模型的局限性
尽管当前皮层类器官系统在模拟人类皮层发生方面具有显著效用，但它们不完全再现体内大脑发育的几个重要特征。虽然皮层类器官有效模拟早期胎儿皮层发生，但它们不完全捕捉后期发育过程，如环路细化、突触修剪和高级胶质细胞成熟，这些过程在人类中比其他灵长类显著延长。一个主要限制是缺乏血管化，这限制了长期培养过程中氧气和营养物质的扩散，并导致大型类器官中的细胞应激、坏死和成熟受损。由于代谢调节和发育时间似乎与皮层扩张密切相关，这些生理限制可能影响正在研究的进化机制本身。这些限制在解释发育节奏的物种特异性差异时尤其相关，因为长期体外培养可能无法完全再现人类皮层成熟后期阶段所需的环境和生理背景。此外，皮层类器官缺乏体内存在的许多外在发育输入，包括免疫、感觉和长程环路相互作用，所有这些都可能塑造皮层发生过程中的祖细胞行为和神经元成熟。
另一个重要挑战是类器官系统在不同分化方案、PSC系和物种之间的可变性和不完全可重复性。此外，由于与胎儿大脑相比类器官中糖酵解应激增加，细胞亚型的代表性不足。尽管定向模式策略的改进增加了一致性，但不同物种类器官之间在发育时间、细胞组成和区域身份上的差异仍然使比较研究复杂化。此外，还有助于人类皮层进化的其他方面，包括联合皮层和下层板区域的相对扩张，以及皮层区域之间连接性的增加。然而，皮层类器官模型由于缺乏区域特化和细胞成熟，并不完全适合研究这些差异。
5.2 研究人类皮层进化的新兴方法和未来方向
尽管有许多重要发现增加了对支撑人类皮层扩张过程的理解，但研究人员设想未来的研究通过适应新技术来探索其他机制。
5.2.1 马赛克和复合类器官
新兴类器官技术越来越能够更精确地探究皮层发生过程中物种特异性发育机制。比较研究中的一个主要挑战是区分细胞内在的进化差异与跨物种不同细胞外环境或培养条件引入的影响。为了解决这个问题，最近开发了马赛克和复合类器官系统，其中来自多个个体或物种的PSC在相同环境中培养。从混合人类PSC系生成的马赛克类器官已被用于减少系间变异性，同时保留发育轨迹和细胞多样性。人类-黑猩猩复合PSC系统，涉及人类和黑猩猩PSC的细胞融合，使得能够直接探究顺式和反式调控对神经发育过程中物种特异性基因表达的贡献，识别出涉及神经元钙信号传导的基因如SSTR2的人类特异性调控。有趣的是，复合PSC系统还揭示了对人类线粒体相对于黑猩猩线粒体的优先保留，表明线粒体基因组的进化差异可能影响细胞代谢，即使在密切相关的灵长类物种之间。总之，这些方法为解析内在遗传程序、代谢和细胞外信号如何共同塑造物种特异性发育时间和祖细胞行为提供了越来越复杂的平台。
5.2.2 进化机制的可扩展功能探究
可扩展功能基因组学的进展也在扩展在类器官系统中系统探究人类特异性发育机制的能力。基于CRISPR的扰动筛选结合单细胞转录组学、谱系追踪和CROP-seq方法已在人类皮层类器官中识别出NP命运规范和神经发育疾病表型的调节因子。然而，迄今为止大多数研究主要关注人类系统内的蛋白质编码基因。将这些方法扩展到比较类器官模型可能使得能够大规模功能探究与皮层扩张相关的HARs、物种特异性增强子和其他进化遗传创新。最近针对人类NP培养物中假定神经发育增强子的CRISPR扰动研究已识别出对祖细胞增殖重要的顺式调控元件，突出了在发育神经组织中系统探究非编码进化机制的可行性。
5.2.3 oRG和祖细胞多样性的比较研究
鉴于oRG在皮层扩张中的重要性，祖细胞多样性的比较功能研究仍然是该领域的主要未来方向。虽然之前的研究已经识别了人类和其他哺乳动物物种之间oRG丰度、增殖行为和转录谱的物种特异性差异，但支配这些差异的分子机制仍未完全理解。最近结合CRISPRi扰动、单细胞转录组学和谱系追踪在原代人类胎儿放射状胶质细胞培养中的工作识别了能够在人类和猕猴祖细胞中调节发育时间和细胞命运决定的转录因子。将类似方法应用于长期比较类器官培养可能有助于阐明物种特异性祖细胞群体如何促进人类中延长的神经发生和增加的皮层复杂性。此外，大多数现有研究集中于人类和非人灵长类之间的比较，以研究最近的进化事件。然而，其他具有大而有脑回皮层物种，如海豚和大象，被认为含有oRG。已成功从海豚和大象分别衍生出皮肤成纤维细胞和iPSC培养物，提高了生成这些物种类器官和oRG研究的可能性。将非灵长类物种纳入比较研究将揭示oRG生物学中高度保守和灵长类特异性机制。
5.2.4 超越皮层
未来的比较研究可能会扩展到大脑皮层以外的其他脑区，这些脑区在人类中也经历了进化多样化。尽管新皮层在人类进化中经历了显著扩张，但其他区域包括小脑和神经节隆起也表现出相对于其他物种增加的复杂性和细胞多样性。模拟这些区域的类器官方案已被开发。已有观察表明，具有oRG样特征的祖细胞群体存在于皮层之外，包括在人类小脑菱唇和神经节隆起内。这些发现提出了可能性，即皮层扩张背后的发育机制，包括延长的祖细胞维持和增加的祖细胞多样性，可能更广泛地促进其他脑区的进化。因此，跨多个脑区的比较类器官研究可能有助于确定是共享的还是区域特异性的发育程序支撑了人类大脑的扩张和增加的复杂性。
5.2.5 超越转录
越来越多的证据进一步表明，物种特异性发育程序在基因表达之外的多个分子水平上受到调控。比较研究已涉及选择性剪接（alternative splicing, AS）、染色质状态、组蛋白修饰、基因沉默和蛋白质转换动力学在调节跨物种发育时间和神经分化中的作用。例如，AS被认为对物种特异性神经元功能和发育程序有显著贡献。大脑还富含微外显子，这是一种特殊类别的短外显子（3-27个核苷酸），在神经元成熟过程中逐渐包含，并经常在神经发育障碍中失调。NOVA1编码皮层发育过程中的剪接调节因子，有趣的是，它包含一个现代人类特异性遗传变异，相对于古老NOVA1修改了神经元连接性。鉴于AS对正确的皮层发育至关重要，并且已在物种间进化，识别类器官发育过程中物种间的差异剪接事件将具有重要意义。使用长读长测序的单细胞AS分析已在人类皮层类器官中描述，可以应用于其他物种的类器官。同时，由Polycomb抑制复合物2（Polycomb repressive complex 2, PRC2）介导的表观遗传抑制，该复合物催化组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化（H3K27me3），已被证明在小鼠和人类系统中调节祖细胞分化和神经元成熟的时机。对分段时钟和运动神经元分化的研究进一步证明，物种特异性生化反应动力学和蛋白质转换速率可以影响跨哺乳动物的发育节奏。因此，在比较类器官系统中结合长读长测序、表观基因组分析、蛋白质组学和代谢分析的新兴多组学方法可能有助于更全面地理解人类皮层发生过程中发育时间和祖细胞行为如何协调。
5.2.6 对神经系统疾病的见解
最后，比较类器官系统可能有助于阐明为什么使人类皮层扩张成为可能的进化过程也可能增加了对神经发育疾病的易感性。许多与NP扩张、发育时间和神经元多样化相关的基因和调控元件也与包括小头畸形、自闭症谱系障碍、精神分裂症和智力障碍在内的疾病相关。参与NP增殖的人类特异性基因，如NOTCH2NL和ARHGAP11B，与先天性脑畸形相关。HARs被发现富集与自闭症谱系障碍和精神神经疾病如精神分裂症和双相情感障碍相关的变异。来自神经发育障碍患者的类器官模型还揭示了NP增殖、神经元分化和发育时间异常。因此，将比较进化方法与疾病建模相结合，可能为人类大脑中独特敏感的发育通路提供重要见解，并最终为针对早期神经发育过程的治疗策略提供信息。
6 结论
PSC衍生的类器官培养物通过允许对以前在人类胎儿大脑中无法获取的发育过程进行直接实验研究，改变了人类大脑进化的研究。比较类器官研究已经揭示了代谢、基因调控、信号传导和细胞结构对祖细胞扩张和发育时间的物种特异性差异的不同贡献。虽然当前系统在模拟皮层发生的后期阶段和皮层进化的更广泛特征方面仍然有限，但新兴策略如马赛克和复合类器官、大规模功能扰动以及纳入非灵长类物种和非皮层脑区为解决这些挑战提供了有前景的途径。研究人员预计，比较类器官研究的持续进展将加深研究人员对人类大脑进化及其与神经系统疾病关系的理解。
