《Non-coding RNA Research》：MicroRNA-21-3p regulation of NADPH oxidase 4 and vascular endothelial growth factor A contributes to hemorrhage in cerebral cavernous malformations
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摘要背景：脑海绵状血管畸形（CCM）是一种易发生出血的血管异常，导致神经功能缺损及生活质量下降。当前治疗手段有限，且血管不稳定的分子机制尚未完全阐明。微RNA（microRNA）已成为血管完整性的关键调节因子。本研究探讨了微RNA-21-3p（miR-21-3
摘要背景：脑海绵状血管畸形（CCM）是一种易发生出血的血管异常，导致神经功能缺损及生活质量下降。当前治疗手段有限，且血管不稳定的分子机制尚未完全阐明。微RNA（microRNA）已成为血管完整性的关键调节因子。本研究探讨了微RNA-21-3p（miR-21-3p）在调节CCM中氧化应激和血管生成中的作用。方法：研究人员采用荧光原位杂交（FISH）技术，评估了20例散发性CCM患者病变组织中内皮细胞和周细胞中miR-21-3p、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）和血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达。在CCM2基因缺失的人脑微血管内皮细胞（BMECs）和周细胞中，研究人员在miR-21-3p模拟物或抑制剂干预后，进行了增殖、通透性、活性氧（ROS）、迁移和管状形成等功能实验。在ccm2敲低的斑马鱼模型中，评估了miR-21-3p对脑出血、血管通透性、血管扩张及血管生成的体内效应。结果：与对照组相比，CCM病变中miR-21-3p表达降低，而NOX4和VEGFA表达升高，并与出血相关。在体外，miR-21-3p模拟物通过直接靶向NOX4和VEGFA，抑制了增殖、通透性、ROS生成和血管生成活性。在体内，补充miR-21-3p可减少ccm2敲低斑马鱼的脑出血、血管渗漏、血管扩张和出芽性血管生成。结论：MiR-21-3p通过调节NOX4介导的氧化应激和VEGFA驱动的血管生成，调控CCM中的血管完整性。miR-21-3p的缺失导致出血，而其恢复则可稳定血管功能。本研究将miR-21-3p确定为CCM的潜在治疗靶点，桥梁了内皮细胞和周细胞生物学，并具有减少脑出血的转化潜力。
**论文解读：miR-21-3p调控NOX4和VEGFA在脑海绵状血管畸形出血中的作用**
**研究背景**
脑海绵状血管畸形（Cerebral Cavernous Malformations, CCM）是一种以扩张、薄壁血管簇为特征的脑部血管异常，其临床重要性在于易引发脑出血，严重影响患者的生活质量。目前，对于位于功能区或脑干的病变，手术切除和立体定向治疗仍面临挑战。因此，随着对CCM发病机制认识的深入，药物治疗成为一个潜在的治疗途径。
CCM主要源于内皮细胞中CCM1、CCM2或CCM3复合物的缺失或突变，这些突变通过调节关键信号通路，如Krüppel样因子（KLF）2/4、内皮-间充质转化、Ras同源家族成员A（RhoA）/Rho相关激酶（ROCK）和Toll样受体4信号通路，导致病变形成。此外，PI3K催化亚基α（PIK3CA）和丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（MAP3K3）的体细胞突变也在散发性CCM中起关键作用。CCM复合物的功能丧失性突变和PIK3CA的体细胞突变会增强内皮细胞中雷帕霉素的机械靶点（mTOR）信号通路，形成类似癌症的复杂机制，促进异常血管生长并导致CCM形成。非编码RNA通过调节基因表达、影响血管生成、炎症、血管完整性、凋亡和氧化应激，在脑血管畸形的发展中起关键作用。微RNA（miR）作为重要的非编码RNA之一，在CCM的诊断、预后预测和治疗中展现出潜在价值。周细胞和神经胶质细胞作为非内皮细胞也参与CCM发病机制。在CCM病变中，周细胞与内皮细胞相互作用可激活血管内皮生长因子A（VEGFA）/VEGFR2信号通路，导致血管生成和血管通透性增加。微RNA可以调节基因表达并影响周细胞和内皮细胞中多个与CCM相关的病理过程，因此可能成为减少CCM出血的宝贵靶点。miR-21已被确定在缺血性卒中和胶质母细胞瘤中调节凋亡和炎症，参与氧化应激和血管生成反应。然而，在CCM疾病中，miR-21-3p在脑出血中的作用仍然未知。斑马鱼已成为研究脑血管发育、血脑屏障（BBB）完整性和出血的强有力脊椎动物模型，其光学透明性和遗传可操作性能够实现脑血管动力学的实时成像，并且CRISPR介导的ccm2嵌合诱变可重现人类CCM特征，为识别治疗靶点提供了平台。
**研究内容与结论**
本研究旨在探讨脑微血管内皮细胞（BMECs）和周细胞中miR-21-3p表达降低是否通过解除对NOX4介导的氧化应激和VEGFA驱动的血管生成的抑制，从而促进CCM脑出血；以及恢复miR-21-3p是否能稳定血管完整性并减少脑出血。研究结合了临床CCM病变标本、CCM2基因缺失的人BMECs和周细胞体外模型，以及CCM2基因敲低的斑马鱼体内模型，揭示了这一机制，并提示miR-21-3p可能是CCM疾病的治疗靶点。该论文发表在《Non-coding RNA Research》。
**主要关键技术方法**
1. **临床样本分析**：研究人员收集了20例散发性CCM患者（中山大学孙逸仙纪念医院）的病变组织，并以5例颞叶癫痫（TLE）和5例多形性胶质母细胞瘤（GBM）患者的病变组织作为对照，进行了荧光原位杂交（FISH）和RT-PCR检测。
2. **体外细胞模型**：利用小干扰RNA（siRNA）敲低人BMECs和脑周细胞中的CCM2基因，建立CCM2缺失的细胞模型，随后进行miR-21-3p模拟物或抑制剂干预，并开展CCK-8增殖、Transwell迁移、管状形成、Transwell通透性和活性氧（ROS）检测等功能实验。
3. **体内斑马鱼模型**：采用吗啉代反义寡核苷酸（MO）敲低斑马鱼的ccm2基因，并同时注射miR-21-3p模拟物进行拯救实验，通过共聚焦显微镜活体成像评估脑出血、血管通透性、血管扩张和血管生成情况。
4. **靶点验证**：通过双荧光素酶报告基因实验验证NOX4和VEGFA是否为miR-21-3p的直接靶基因。
**研究结果**
**3.1 人类CCM中miR-21-3p表达降低，其靶基因NOX4和VEGFA表达升高**
通过FISH染色，研究人员发现，与TLE和GBM对照相比，CCM病变的内皮细胞（ECs）和周细胞中miR-21-3p表达显著降低，而NOX4和VEGFA表达显著升高。RT-PCR结果也证实，与正常脑组织相比，CCM病变中miR-21-3p、CCM1和CCM2的mRNA水平显著降低。
**3.2 脑出血CCM中miR-21-3p表达降低，NOX4和VEGFA表达升高**
在20例CCM患者中，13例在MRI上表现出脑出血。研究人员通过FISH定量分析发现，与无出血组相比，出血组CCM病变的内皮细胞和周细胞中miR-21-3p表达显著降低，而NOX4和VEGFA表达显著升高，表明miR-21-3p的表达下调与脑出血相关。
**3.3 在CCM2基因缺失的人BMEC模型中，miR-21-3p调节NOX4和VEGFA的表达**
在CCM2敲低的BMECs中，miR-21-3p表达降低，而NOX4和VEGFA的mRNA和蛋白水平升高。miR-21-3p模拟物干预可抑制NOX4和VEGFA的上调，而miR-21-3p抑制剂则加剧了这种上调。与NOX4或VEGFA siRNA共处理可减弱miR-21-3p抑制剂的效果。
**3.4 NOX4和VEGFA是miR-21-3p的直接靶基因**
双荧光素酶报告基因实验证实，miR-21-3p可直接结合NOX4 3′UTR上的位点，抑制其表达。同时，已有研究也证实miR-21-3p可直接靶向VEGFA。
**3.5 在人类CCM2缺失的BMEC模型中，miR-21-3p抑制增殖、通透性、ROS和血管生成**
CCK-8实验显示，CCM2敲低后BMEC增殖增加，miR-21-3p模拟物抑制了这种增殖，而抑制剂则加剧了增殖。Transwell通透性实验显示，miR-21-3p模拟物抑制了CCM2敲低引起的通透性增加。DHE和DCFH-DA检测显示，miR-21-3p模拟物抑制了CCM2敲低引起的ROS生成。Transwell迁移和管状形成实验表明，miR-21-3p模拟物抑制了CCM2敲低后增强的细胞迁移和管状形成能力。这些效应均通过NOX4或VEGFA siRNA共处理被减弱。
**3.6 在CCM2基因缺失的人周细胞模型中，miR-21-3p调节NOX4和VEGFA的表达**
在周细胞中的结果与BMECs类似，CCM2敲低后，miR-21-3p表达降低，NOX4和VEGFA表达升高，而miR-21-3p模拟物可抑制这种上调。
**3.7 在人类CCM2缺失的周细胞模型中，miR-21-3p抑制ROS、增殖和通透性**
在周细胞中，CCM2敲低导致超氧阴离子水平、增殖和通透性增加，miR-21-3p模拟物均能抑制这些效应，而抑制剂则加剧。这些效应主要通过NOX4或VEGFA介导。
**3.8 在ccm2基因敲低的斑马鱼模型中，miR-21-3p调节NOX4和VEGFA的表达**
在ccm2敲低的斑马鱼脑中，miR-21-3p表达降低，nox4和vegfa表达升高。miR-21-3p模拟物可抑制ccm2敲低后nox4和vegfa的表达上调。
**3.9 在ccm2基因敲低的斑马鱼模型中，miR-21-3p减少脑出血、血管通透性、血管扩张和血管生成**
活体成像显示，ccm2敲低导致斑马鱼出现脑出血、血管渗漏（DAPI阳性细胞核增加）、血管扩张（原中脑通道[PMBC]面积增大）和血管生成（肠下静脉[SIV]出芽增加）。miR-21-3p模拟物干预显著减少了出血发生率、出血面积、血管渗漏、血管扩张和血管生成。
**讨论与结论**
**讨论总结**：本研究阐明了内皮细胞和周细胞中miR-21-3p与人类CCM病变脑出血的关联，并在CCM2基因缺失的细胞模型和ccm2敲低的斑马鱼模型中加以验证。研究发现，在CCM2缺失的状态下，增加miR-21-3p可通过下调NOX4和VEGFA，抑制细胞增殖、通透性、ROS表达、细胞迁移和管状形成，从而在斑马鱼模型中减少脑出血、血管通透性、血管扩张和血管生成。研究揭示了miR-21-3p/NOX4/ROS通路在CCM2缺失的BMECs和周细胞中发挥关键作用。NOX4表达增加促进ROS过度产生，导致BMECs和周细胞功能障碍，进而增加血管通透性和细胞增殖。miR-21-3p模拟物可显著抑制上调的NOX4，减少ROS生成，并减轻斑马鱼模型中的脑出血。此外，研究还发现，VEGFA表达升高和miR-21-3p表达降低与CCM脑出血相关。miR-21-3p通过调节其靶基因VEGFA来发挥抗出血的保护作用。研究还讨论了miR-21-3p/NOX4/VEGFA轴与经典CCM信号通路（如KLF2/4、RhoA/ROCK、PI3K/AKT/mTOR）的潜在交叉点，以及miR-21-3p疗法的递送挑战。研究局限性包括仅在斑马鱼模型中验证抗出血作用，未在哺乳动物模型中验证，且临床样本量较小。
**结论翻译**：本研究表明，miR-21-3p通过调节NOX4介导的氧化应激和VEGFA驱动的血管生成来调控CCM中的血管完整性。miR-21-3p的缺失导致出血，而其恢复则可稳定血管功能，这一点已在人类CCM病变、Ccm2缺失的人类细胞和Ccm2敲低的斑马鱼模型中得到证实。因此，miR-21-3p可能是CCM的潜在治疗靶点，桥梁了BMEC和周细胞生物学，并具有减少脑出血的转化潜力。
