凋亡过程中二级蛋白酶解隐藏的Caspase介导切割事件

《Protein Science》：Caspase-mediated cleavage events hidden by secondary proteolysis during apoptosis

　　

Caspase是半胱氨酸蛋白酶，通过切割特定蛋白质调控细胞死亡、炎症和分化等一系列细胞过程。N-terminomics等蛋白质组学方法是鉴定被切割蛋白质及其切割位点的核心手段。研究人员近期报道了分化与死亡C2C12成肌细胞的N-terminomics研究，鉴定出许多新的Caspase底物与切割位点。本文对该数据集的进一步分析表明，在研究人员及其他N-terminomics数据集中均存在“隐藏”的Caspase底物。研究人员提出，对于一部分蛋白质，Caspase切割后会经二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase，DPP）从新生成N端移除两个氨基酸。由于新N端的肽序列被用于识别切割位点，这会隐藏Caspase介导的切割事件。其意义在于，N-terminomics数据集可用于揭示迄今未识别的Caspase底物，并提供更多关于细胞命运决定的信息。在C2C12成肌细胞中，研究人员发现凋亡成肌细胞中存在“隐藏”底物的切割，而在同样含有活性Caspase-3的分化成肌细胞中不存在该切割，提示切割可能用于识别凋亡细胞。更好地理解Caspase与其他蛋白酶之间的相互作用及其对Caspase底物的连续作用，有助于进一步阐明细胞命运决定。

研究背景方面，Caspase作为半胱氨酸蛋白酶，通常通过切割特定蛋白质调控细胞死亡、炎症和分化等多种细胞过程，其切割位点遵循Schechter-Berger命名法，P1位强烈偏好天冬氨酸（D）。鉴定Caspase底物对理解其调控机制至关重要，N-terminomics（N末端组学）作为强大蛋白质组学技术，通过标记蛋白酶解产生的新N端并富集质谱鉴定，已在Caspase研究中广泛应用，包括正向N-terminomics（标记细胞内新末端以识别行为变化中的切割事件）和反向N-terminomics（在细胞裂解物中添加特定蛋白酶后标记新末端以明确蛋白酶身份）。然而，现有研究依赖P1=D判定Caspase底物可能存在局限，研究人员在前期C2C12成肌细胞分化与死亡的正向N-terminomics数据集中，发现部分切割事件P1=脯氨酸（P）且P3=D，提示可能存在二级蛋白酶解掩盖真实Caspase切割位点，即Caspase切割后DPP移除新N端两个氨基酸（Xaa-Pro），导致N-terminomics误判P1为P而非D，使底物“隐藏”，这一问题尚未被系统阐明，且已知重要底物BCL2L1从未在N-terminomics中被发现，因此开展本研究以揭示隐藏底物及蛋白酶级联作用。

主要关键技术方法包括：分析C2C12成肌细胞五种群体（成肌细胞、分化中、凋亡、肌管、储备细胞）及反向N-terminomics（重组小鼠Caspase-3处理裂解物）的N-terminomics数据集，筛选P1=P且P3=D的切割事件；分析DegraBase中人凋亡细胞系（Jurkat、MM1S、U266、DB）N-terminomics数据验证跨物种保守性；HEK293T细胞过表达表位标签候选蛋白（JUND、POLR1C、MTSS1、BCL2L1），用纯化重组小鼠Caspase-3体外切割及依托泊苷/TPCK诱导凋亡体内切割验证；构建BCL2L1 Δ62 A64R突变体，用DPP抑制剂（Talabostat、1G244）及DPP8/DPP9 siRNA验证DPP加工Caspase切割产物；通过AP1荧光素酶报告实验评估JUND切割片段转录活性，BHK细胞共转染GFP与BCL2L1突变体评估凋亡表型。

研究结果如下：

2.1 Hidden substrates（隐藏底物）：分析C2C12凋亡细胞N-terminomics所有切割事件（P1=Xaa），发现凋亡细胞中P1=P且P6-P3序列标志似D-X-X-D（Caspase-3典型位点），共31个蛋白质符合P1=P且P3=D，仅见于凋亡群体而非分化等其他群体，总唯一切割数相似排除检测偏倚；裂解时加广谱半胱氨酸/丝氨酸蛋白酶抑制剂排除裂解后人工产物，反向N-terminomics仅3个符合，支持该特征为凋亡细胞内产生；其中3个为已知Caspase底物切割位点，6个为新位点已知底物，22个为新底物，分布与P1=D底物显著差异（p=1.45×10^?27）；跨人细胞系DegraBase分析获85个P1=P/P3=D切割蛋白，35个鼠人100%保守，7个P3为谷氨酸（E，Caspase-3可切），14个不保守，另有14个P1=A/P3=D，支持两步切割假说（Caspase切D生成Xaa-Pro N端，DPP移除两氨基酸致P1显P）。

2.2 Corroborating the identification of new substrates（新底物鉴定 corroboration）：选JUND、POLR1C、MTSS1（C2C12及人细胞系保守切割位点），HEK293T裂解物体外加重组Caspase-3，免疫印迹显示均被切割，突变假定Caspase切割位点（如JUND TVPD→TVPA、MTSS1 TVPD→TVPA、POLR1C HTTD→HTTA）降低切割；JUND双突变D242A+D248A完全消除预测片段，单突变D242A未完全消除提示存次要位点D248，突变D81/D85消除额外30 kDa片段；凋亡诱导（依托泊苷/TPCK）HEK293T细胞中三者均被切割，突变消除预测片段，POLR1C未检到片段可能因不稳定或HA标签被切；免疫沉淀凋亡细胞JUND质谱鉴定到Caspase-3切D242生成V₂₄₃PSFGDSPPLSPIDMDTQER₂₆₉及DPP切后S₂₄₅FGDSPPLSPIDMDTQER₂₆₉肽段，确证切割模式。

2.3 Testing if DPPs process a product of caspase activity（测试DPP是否加工Caspase活性产物）：构建BCL2L1 Δ62（Caspase切割C端片段）A64R突变体（丙氨酸变精氨酸，DPP切后N端精氨酸触发N-end rule途径降解），HEK293T表达该突变体，加DPP抑制剂Talabostat（抑DPP7/8/9）或1G244（抑DPP8/9非DPP7）增加蛋白水平；转染DPP8或DPP9 siRNA亦增加突变体水平，表明Caspase切割产物是DPP8/DPP9底物，排除DPP7作用。

2.4 Caspase cleavage of JUND abolishes its transactivation activity（JUND Caspase切割消除转录激活活性）：JUND切割位点在转录激活域与DNA结合域间，共转染全长JUND（增AP1荧光素酶活性）与截断突变体（JUND_1-244模拟Caspase N端片段、Δ243模拟C端片段、Δ245模拟DPP加工C端片段），后者显著降低基础AP1活性，提示切割消除转录激活且可能产生显性负性片段；BCL2L1截断突变体（Δ62模拟Caspase C端、Δ64模拟DPP加工、Δ62/A64P防DPP切）转染BHK共GFP，均较空载体减少~50% GFP阳性细胞并增凋亡细胞比例（p<0.01）。

讨论部分总结：N-terminomics虽能富集新N端鉴定切割位点，但存局限（亚甲基化标记未阻断N端、标记效率受序列影响、质谱鉴定偏倚）。本研究揭示自身及他人数据集存二级蛋白酶解隐藏的Caspase底物，裂解加抑制剂及正向/反向差异排除裂解人工产物，为细胞内真实生物学过程。JUND、MTSS1、POLR1C在多种细胞凋亡中被Caspase切割且P4-P4′ DXP基序保守，支持其为隐藏底物；JUNB与JUND切割调控不同（JUNB无DPP参与）。BCL2L1切割功能重要却未在N-terminomics发现，因DPP快速加工隐藏；隐藏底物仅见于凋亡非分化细胞（虽有活性Caspase-3），提示其可作凋亡标记区分死亡与非死亡命运（如ICAD切割兼分化与凋亡）。DPP7/8/9为胞内丝氨酸蛋白酶，抑制剂排除DPP7，siRNA证DPP8/9参与，其与既往报道MXP基序（MAP+DPP加工）不同，本研究为Caspase依赖的DPP切割。结论为N-terminomics数据集可揭示蛋白酶相互作用，凋亡涉及Caspase（半胱氨酸）与DPP8/9（丝氨酸）连续蛋白酶解隐藏Caspase切割产物，由此鉴定出新Caspase底物，其切割强关联细胞死亡而非Caspase诱导的非死亡命运。

研究结论部分翻译：N-terminomics数据集可揭示不同蛋白酶间的相互作用/关系，我们表明凋亡涉及半胱氨酸（Caspase）与丝氨酸蛋白酶（DPP8/9）对特定蛋白质的连续蛋白酶解，可“隐藏”Caspase切割产物。因此，我们鉴定出新的Caspase底物，其切割强烈关联细胞死亡而非Caspase诱导的其他非死亡命运。