《Protein Science》：Evolutionary history and recombination in the mitochondrial carrier SLC25 superfamily analyzed by similarities in the exon and transmembrane α-helix sequences
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线粒体载体（mitochondrial carriers, MCs）构成一个超家族，也称为溶质载体家族25（solute carrier family 25, SLC25），其特征是保守的特征基序序列和六次跨膜α-螺旋转运结构域。它们转运多种底物，范围从质子、
线粒体载体（mitochondrial carriers, MCs）构成一个超家族，也称为溶质载体家族25（solute carrier family 25, SLC25），其特征是保守的特征基序序列和六次跨膜α-螺旋转运结构域。它们转运多种底物，范围从质子、无机离子、柠檬酸循环中间体、氨基酸到核苷酸和辅因子。超家族成员可分为亚家族，每个亚家族具有不同的底物特异性。为了理解不同亚家族如何进化，研究人员分析了来自高度分化生物的MCs的外显子（具有保守边界）和六个跨膜α-螺旋的蛋白质序列。结果表明，一些MC亚家族的所有外显子和跨膜α-螺旋与一个密切相关的亚家族最相似，这与基因重复和从最后一个共同祖先发生突变分化的情景一致。然而，几个MC亚家族似乎是外显子和跨膜α-螺旋的镶嵌体，与不同且遥远的亚家族最相似，这在某些情况下可以通过进化过程中超家族基因间的重组来解释。后一种机制可能在通过组合先前已优化用于结合底物特定部分的MC转运结构域片段，形成具有不同底物特异性的新亚家族中发挥了作用。本研究揭示了MC亚家族之间新的进化关系，并可能为蛋白质超家族如何扩展以及如何研究其进化提供线索。
线粒体载体（mitochondrial carriers, MCs）属于溶质载体家族25（solute carrier family 25, SLC25）超家族，主要定位于线粒体内膜，具有保守的六次跨膜α-螺旋转运结构域和特征基序（signature motif）。它们转运多种底物，包括质子、无机离子、柠檬酸循环中间体、氨基酸、核苷酸和辅因子，在代谢和生理中至关重要。然而，不同底物特异性的亚家族如何通过进化形成，尤其是基因重复（gene duplication）与重组（recombination）各自扮演的角色，尚不清楚。传统系统发育分析难以揭示亚家族间片段水平的关系。为了阐明MC超家族的进化机制，研究人员开展了此项研究，论文发表在《Protein Science》。
研究人员从高度分化的物种（包括动物、真菌和植物）中收集了768个MC蛋白质序列，基于系统发育分析和生化确定的底物特异性将其划分为51个亚家族，并估计了各亚家族在进化中出现的时间。研究核心是分析亚家族外显子（exon）和跨膜α-螺旋（transmembrane α-helix）的序列相似性。外显子分析利用人类（Homo sapiens）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的保守内含子位置（intron positions, IPs）定义外显子边界，通过成对比对计算序列身份（sequence identity, SI）和比对分数，并分配置信分数（confidence score）。跨膜α-螺旋分析提取H1至H6的中心区域，进行无空位比对，依据同一亚家族内命中序列的百分比判断证据强度（strong/good/weak）。此外，应用遗传算法重组检测（Genetic Algorithm for Recombination Detection, GARD）验证潜在重组事件。所有分析均使用总序列集和“OLD”序列集（仅包含早于查询亚家族出现的亚家族序列），以推断进化方向。
**2.1 分析MC外显子和跨膜α-螺旋片段的序列相似性**
通过将MC亚家族划分为5个主要聚类（MC-NT2、MC-NT1、MC-CA、MC-AAP、MC-AAN）以及聚类外的亚家族，研究人员将相似性分析结果映射到示意图上，并整合了内含子位置信息。结果显示，许多亚家族是外显子和跨膜α-螺旋的镶嵌体，其最相似序列来自不同亚家族，这使得“解读”进化历史成为可能。当亚家族的所有片段均与同一谱系中的亚家族最相似时，解释为基因重复；当片段与远缘或不同谱系的亚家族最相似时，则视为重组或外显子 shuffling 的证据。
**2.2.1 MC-NT2聚类亚家族的进化历史**
通过外显子和跨膜α-螺旋相似性分析，研究人员发现MC-NT2聚类中多数亚家族（如MFT/FAD、NDT、peCFNC、PNC、peANT）主要表现出基因重复的进化模式。例如，MFT/FAD的片段最相似于MC-NT1聚类的TPC和APC亚家族，提示其共同祖先连接了两个聚类。MFT/FAD与peCFNC共享5个相同的内含子位置，进一步支持近缘关系。但peANT的H3区域、PNC的H6区域等存在非相似片段，GARD分析支持这些区域的重组，表明重组可能参与了底物特异性的分化。
**2.2.2 MC-NT1聚类亚家族的进化历史**
分析表明，MC-NT1聚类亚家族（如TPC、CoC、YPR011C、AAC、APC）的片段相似性主要发生在聚类内部，与系统发育树一致，推测通过基因重复进化。例如，CoC与YPR011C共享多个跨膜α-螺旋和4个相同内含子位置，关系密切。新出现的异构体（如哺乳动物AAC4、植物ER-ANT和PM-ANT）的所有外显子均最相似于其所属亚家族，可作为基因重复的阳性对照。未检测到强重组信号。
**2.2.3 MC-CA聚类亚家族的进化历史**
分析提示MC-CA聚类（如OGC、DIC、UCPs、OAC等）的进化涉及基因重复和重组。OGC的片段几乎全部最相似于DIC，UCP2-3和UCP4的部分外显子也最相似于DIC，暗示DIC是这些亚家族的祖先。值得注意的是，动物UCP2-3的N端外显子最相似于MC-NT1聚类的TPC，且共享一个相同的内含子位置，而在植物版本中则不同。GARD分析支持这一外显子通过重组从TPC转移至动物UCP2-3。UCP1、UCP5-6、AT4G03115和OAC的片段相似性模式也提示基因重复或重组。
**2.2.4 MC-AAP聚类亚家族的进化历史**
在MC-AAP聚类（如ORC、ALC、CAC、SLC25A45/A47/A48）中，片段相似性分析表明：ORC、ALC和YMC/BOU可能来自共同祖先；CAC源自ALC和ORC；SLC25A45/A47/A48主要源自ALC，但其H3-H4区域最相似于CAC。GARD分析强烈支持该亚家族由ALC通过基因重复形成，并在H3-H4区域发生重组事件，这解释了其底物（如胆碱和三甲基赖氨酸）的特异性。
**2.2.5 MC-AAN聚类亚家族的进化历史**
GC（谷氨酸载体）的所有外显子和跨膜α-螺旋几乎全部最相似于AGC（天冬氨酸/谷氨酸载体），提示GC由AGC基因重复产生。然而，AGC的N端半段有3个外显子最相似于MC-CA聚类（主要是OGC），且含两个MC-CA特异的内含子位置；其H4最相似于谷胱甘肽载体SLC25A39-A40。这些结果表明AGC的N端片段和H4可能分别通过重组来自MC-CA聚类和SLC25A39-A40，与AGC转运含羧基侧链的氨基酸底物相吻合。
**2.2.6 主要聚类外MC亚家族的进化历史**
对于ODC、CIC、SFC等聚类外亚家族，片段相似性分析揭示了与多个远缘亚家族的复杂重组关系。例如，CIC的H2-H4区域可能来自SFC，H5来自SAMC；ODC的H3和H6来自SFC，H1来自MFRN。GARD分析支持这些重组事件。此外，SLC25A39-A40、GlyC、MFRN和SAMC之间存在相互的片段相似性，提示一条可能的进化路径：SAMC源自MC-NT1-2和MC-AAP聚类的重组，MFRN从SAMC分化，SLC25A39-A40从MFRN分化，GlyC从SLC25A39-A40分化，且部分区域通过重组形成。
**讨论与结论**
本研究通过创新性地分析外显子和跨膜α-螺旋序列，揭示了MC超家族进化中基因重复和重组共同作用。许多亚家族是片段镶嵌体，其中重组事件可能通过组合不同亚家族中已优化用于结合底物特定部分的转运结构域片段，从而产生新的底物特异性。例如，SLC25A45/A47/A48的H3-H4重组区域与其识别季铵化合物相关；AGC的N端片段来自羧酸盐转运亚家族，H4来自氨基酸转运亚家族，与其底物（同时含氨基和羧基侧链）匹配；SAMC的片段来自核苷酸和氨基酸转运亚家族，与其底物（S-腺苷甲硫氨酸，一种核苷酸-氨基酸杂合体）一致。研究结论总结如下：线粒体载体超家族的外显子和跨膜α-螺旋进化分析表明，基因重复产生整基因复制，而重组导致不同亚家族片段融合，形成具有新底物特异性的亚家族；许多内含子位置随片段转移；该分析方法可推广至其他蛋白质超家族，为理解超家族扩展和功能分化提供新工具。
