AP2/ERF转录因子StGAME9的功能丧失消除了马铃薯植株中甾体糖苷生物碱生物合成的激活和诱导

《Plant Physiology and Biochemistry》：Loss of function of the AP2/ERF transcription factor StGAME9 abolishes activation and induction of steroidal glycoalkaloid biosynthesis in potato plants

　　

甾体糖苷生物碱（SGAs）是存在于某些茄科（Solanaceae）物种中的有毒防御物质，包括主要作物如茄子、番茄和马铃薯。糖苷生物碱代谢9（GAME9）最初在番茄和马铃薯中被鉴定为APETALA2/乙烯响应因子（AP2/ERF）转录因子，调控SGA生物合成中的关键基因。然而，内源性GAME9在马铃薯中的空间效应仍大部分未探索，特别是在块茎中，突出了理解这一重要主食作物中SGA生物合成激活和诱导的知识空白。在这里，研究人员通过无DNA的CRISPR/Cas9生成了马铃薯StGAME9敲除突变体。与野生型相比，敲除突变体叶片中SGA水平显著降低，块茎中几乎不含SGA。值得注意的是，即使在两种SGA诱导条件（损伤和光照）下，突变体块茎中SGA积累仍保持最低，表明可诱导的SGA生物合成丧失。对敲除突变体（Stgame9）的综合转录组和代谢组表征揭示了基因表达和代谢的广泛重编程，不仅影响SGA和甾醇途径，还影响更广泛的代谢过程，Stgame9块茎中与胁迫相关的代谢反应减弱。尽管有这些变化，Stgame9植株在温室和田间条件下均表现出正常的生长表型。研究人员的发现证实了GAME9在马铃薯中调控基础和诱导的SGA生物合成中的关键作用。结果进一步表明，StGAME9参与调控生物合成途径上更广泛、复杂且相互连接的网络，其中马铃薯代谢表现出显著的稳健性和补偿能力，以缓冲StGAME9的丧失。

**论文解读：StGAME9功能丧失对马铃薯甾体糖苷生物碱生物合成的影响**

**研究背景与问题**
甾体糖苷生物碱（SGAs）是茄科植物（如马铃薯、番茄、茄子）中产生的有毒次生代谢产物，参与植物防御。在马铃薯（Solanum tuberosum）中，主要SGAs为α-茄碱和α-卡茄碱，其含量在块茎中通常较低，但受损伤、光照等胁迫条件诱导显著升高，超出食品安全推荐限值（<200 mg kg^-1鲜重）。SGAs生物合成途径中，胆固醇作为直接前体，经一系列羟化、转氨、糖基化反应生成SGAs。AP2/ERF转录因子GAME9（也称JRE4）被证实可调控SGA途径关键基因，在番茄和马铃薯中过表达GAME9增加SGA含量，而沉默或突变则降低SGA水平。然而，内源性GAME9在马铃薯中功能丧失的全面效应，尤其是块茎中的空间作用及对诱导条件的响应，尚不清楚。本研究旨在通过CRISPR/Cas9敲除马铃薯StGAME9，解析其缺失对SGA生物合成、代谢网络及植株表型的影响，为低SGA马铃薯育种提供理论基础。

**研究方法**
研究人员以马铃薯淀粉品种‘Kuras’为材料，采用无DNA的CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物转染原生质体，生成StGAME9突变体。通过高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）测定SGA含量，气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）分析甾醇谱，RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）进行非靶向代谢组学分析。在温室和田间条件下评估突变体表型，并设置损伤（48 h）和光照（8 d）诱导处理。统计方法包括单因素/双因素方差分析（ANOVA）及Dunnett事后检验，转录组差异表达基因（DEGs）筛选标准为|log₂FoldChange|>2且校正p<0.01。

**研究结果**
**3.1 初始筛选显示StGAME9突变体SGA水平低**
通过CRISPR/Cas9靶向StGAME9外显子1，获得155个再生芽，其中108个突变体（编辑效率70%）。TLC半定量筛选显示，完全敲除突变体（所有等位基因发生移码或框内突变）SGA水平低于检测限。

**3.2 Stgame9植株在温室中生长正常，SGA水平显著降低**
选取三个完全敲除事件（G9-25、G9-30、G9-77），温室栽培后植株高度较野生型降低20%-30%，但块茎产量与野生型相当或略高。UHPLC-MS/MS证实叶片总糖苷生物碱（TGA）降至野生型的1.5%以下，块茎TGA低至0.13-0.22 mg kg^-1鲜重（<0.24%野生型），且框内突变与移码突变效果相似。

**3.3 转录组分析揭示Stgame9突变体中关键SGA基因表达改变**
RNA-seq分析叶片和块茎（未处理）样本，发现203个DEGs（叶片）和122个DEGs（块茎）。共同下调的19个基因中，11个参与甾醇/SGA途径，包括SGT3、SMO1-L、GAME15、16DOX、SGT1、DPS等。GO和KEGG富集分析显示糖基转移酶活性及初级/次级代谢途径显著改变。对59个SGA/甾醇相关基因的靶向分析表明，胆固醇下游基因表达下调幅度强于上游基因，如DPS、SGT3、16DOX等显著下调，而CYP72A186和SGT2表达未变。

**3.4 Stgame9突变体中甾醇和代谢物谱改变**
GC-TOF-MS分析显示，三个突变体叶片中C-24烷基化甾醇（如豆甾醇）水平降低，胆固醇水平变化不一致。对164个代谢物的半靶向分析中，15个（叶片）和27个（块茎）代谢物显著改变。SGA相关代谢物（α-茄碱、α-卡茄碱、α-茄边碱）大幅降低，而脂肪酸、氨基酸、核苷酸代谢物（如赖氨酸、酪氨酸、5'-甲硫腺苷）升高，表明代谢网络重编程。

**3.5 Stgame9块茎对损伤或光照处理的响应减弱**
野生型块茎经损伤或光照后TGA升高约3倍，而三个突变体块茎TGA仍保持极低水平。转录组分析显示，野生型诱导的3593个（损伤）和2501个（光照）DEGs在突变体中减少至2702和1925个，且SGA/甾醇相关基因（如SMO1-L、16DOX、SGT3）诱导程度大幅减弱。代谢组分析中，野生型中组胺、茄解碱等防御相关代谢物在诱导后显著积累，而突变体无此反应；脂质代谢物（如溶血磷脂）在突变体诱导后仍维持低水平。

**3.6 田间条件下Stgame9与温室观察一致**
选择事件G9-77进行田间试验，其株高、产量、形态与野生型无差异。块茎TGA含量极低，且损伤/光照处理后仍不积累。块茎加工所得淀粉、纤维、蛋白质组分中TGA也显著降低，如蛋白质组分中TGA为4.1 mg kg^-1干重，低于安全限值（150 mg kg^-1），而野生型蛋白质组分TGA高达5791 mg kg^-1。

**讨论与结论**
讨论部分指出，StGAME9敲除导致SGA水平大幅降低，且存在等位基因剂量效应：完全敲除（四个等位基因均突变）是获得SGA几乎为零的块茎所必需，而部分敲除仍可维持部分SGA合成。转录组和代谢组分析表明，StGAME9缺失不仅影响SGA特定途径，还波及上游甾醇代谢及更广泛的初级/次级代谢网络，但马铃薯代谢具有稳健性，突变体在温室和田间均正常生长。诱导实验证明，StGAME9是SGA诱导性生物合成的关键调控因子，其缺失导致损伤和光照诱导的SGA积累完全丧失。

**结论翻译**：总之，Stgame9突变体的转录组和代谢组分析揭示了StGAME9敲除对基因表达和代谢的广泛影响，特别是在SGA、甾醇和防御相关途径中。这些变化超出了线性SGA生物合成路线，反映了跨相互连接代谢网络的更广泛、更复杂、多维的调控效应。值得注意的是，当Stgame9植株块茎受到光照或损伤处理时，胁迫诱导的代谢反应（包括SGA积累）被强烈减弱，突出了StGAME9在SGA生物合成胁迫诱导中的关键作用。尽管存在广泛的转录组和代谢组改变，Stgame9植株在温室和田间条件下表现出相对正常的生长和表现。显然，StGAME9转录因子对遗传回路的作用独立于正常的马铃薯生长和表现，表明在多个功能基因重复的环境中进化特化。StGAME9突变体块茎中达到的无SGA状态，是通过无DNA基因组编辑技术成功消除抗营养化合物的一个值得注意的应用。田间生长的StGAME9突变体块茎中极低的SGA水平，也提高了来自马铃薯淀粉加工副产物中富含蛋白质和纤维组分的安全性和潜在利用价值，尽管在考虑任何工业应用之前，需要进行更大规模和更详细的田间评估。本研究中StGAME9调控的核心SGA相关基因，为未来旨在减少或消除栽培马铃薯块茎中SGA以增强营养价值的策略提供了宝贵见解，也可能在从头驯化策略中解决野生马铃薯物种中高SGA水平的问题。