激酶控制的别构开关的设计与优化

《Nature Methods》：Design and optimization of a kinase-controlled allosteric switch

　　

翻译后调控（Post-translational control）能够实现细胞行为的快速和精确调控。尽管具有这些优势，但构建基于磷酸化（phosphorylation）的合成电路（synthetic circuits）的通用策略仍然有限。在此，研究人员推测，工程化别构（engineered allostery）这一已被应用于设计光和化学门控蛋白质开关（protein switches）的技术，也可以用于设计磷酸化控制的蛋白质开关（phospho-switches，磷酸化开关）。研究人员以一个别构可控的Gal4转录因子（transcription factor）作为支架，证明了一个经典的激酶（kinase）F?rster共振能量转移（F?rster resonance energy transfer，FRET）生物传感器（biosensor）架构可以用作磷酸化开关设计的起点。研究人员优化了磷酸化开关的所有特征，以开发一个ERK控制的转录因子，其转录输出具有20倍的磷酸化依赖性变化。由此产生的合成ERK响应转录因子（synthetic ERK-responsive transcription factor）的响应灵敏度与c-fos启动子（c-fos promoter）相当，并揭示了哺乳动物发育类器官（developmental organoids）中的空间ERK信号模式（spatial ERK signaling patterns）。研究人员进一步表明，它们的开关架构可以推广到其他输入激酶和别构控制靶标。这项工作为新一代用于生物传感（biosensing）和合成生物学（synthetic biology）应用的激酶响应工具提供了一个通用平台。

**背景介绍**

细胞依赖蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）作为胞内信息的主要载体。蛋白激酶（protein kinases）被多种刺激激活，并调控包括细胞骨架组装、代谢、蛋白质定位和基因表达在内的多种过程。磷酸化还能将多个激酶和底物连接成网络，执行信号整合（signal integration）、扩增（amplification）和反馈控制（feedback control）等信号处理功能。然而，尽管生物工程师长期以来能够构建合成转录电路（synthetic transcriptional circuits），但工程化翻译后网络（post-translational networks）的能力却非常有限。近期研究已开始展示合成翻译后调控（synthetic post-translational control）在感知和重连致癌状态、构建神经网络以在细胞中进行信息处理以及改进工程化细胞疗法方面的潜力。许多研究聚焦于工程化蛋白酶-底物相互作用，以实现刺激依赖性的效应域不可逆切割。与蛋白质切割不同，蛋白质磷酸化的可逆性为实现时空上更精细的响应提供了双向控制的可能。基于磷酸化的合成逻辑（Synthetic phosphorylation-based logic）将使直接与激酶组（kinome）交互、感知激酶编码的细胞状态并触发期望的响应成为可能。工程化别构（Engineered allostery）是实现刺激依赖性蛋白质功能控制的一个强大概念。在工程化别构中，一个刺激调控的蛋白质结构域（开关）被插入到靶蛋白的特定位置，使得开关的构象变化改变靶蛋白的功能。已有几种结构域可作为合适的刺激依赖性开关，响应光照或小分子添加而改变构象。然而，目前还没有可用的开关能将蛋白质磷酸化转化为蛋白质活性的别构变化。一个激酶控制的磷酸化依赖性开关可以立即将磷酸化调控赋予先前已设计为受光或小分子调控的多种靶蛋白。

**研究内容与结论**

在这项研究中，研究人员发现一个常用的F?rster共振能量转移（FRET）激酶生物传感器（kinase biosensor）为开发磷酸化敏感的别构开关提供了起点。他们证明，当将细胞外信号相关激酶（ERK）的EKAR生物传感器插入到Gal4转录因子的一个先前确定的别构位点时，它可以作为一个原型激酶控制开关。研究人员系统地优化了开关的每个组件，以改善其最大振幅和动态范围，揭示了与FRET生物传感器不同的、实现磷酸化依赖性别构的设计原则。最终设计的开关在磷酸化和非磷酸化状态之间实现了超过20倍的转录输出变化。他们证明，这种合成的激酶控制转录因子可以作为ERK激酶活性的优秀生物传感器，其灵敏度可与广泛使用的c-fos启动子相媲美，并能检测哺乳动物类器官发育过程中的空间信号模式。该开关架构可推广到多种激酶和靶蛋白，包括一个JNK控制的转录因子、一个ERK控制的肌动蛋白纳米抗体（actin nanobody）以及一个将ERK活性连接到细胞突起的合成信号效应器（synthetic signaling effector）。总的来说，这项策略将合成生物学家的翻译后调控工具箱扩展到了多种激酶和效应蛋白，在生物传感器设计、药物筛选和细胞疗法中具有潜在应用。该论文发表在《Nature Methods》。

**主要技术方法**

研究人员基于工程化别构概念，将FRET激酶活性报告子（KARs）的传感区重新用作别构开关。他们使用组合型Golden Gate克隆系统（QCTK）快速生成和测试多种开关变体。利用AlphaFold3进行蛋白质结构预测以验证开关机制。通过OptoSOS光遗传学系统特异性激活ERK通路，结合流式细胞术和活细胞成像定量分析开关性能。采用piggyBac随机整合系统在HEK293T细胞和鼠胚胎干细胞（mESCs）中生成稳定细胞系，用于表征和类器官（gastruloids）实验。

**研究结果**

**1. 将基于FRET的KARs重新用作别构开关**
研究人员通过将EKAR（ERK激酶活性报告子）传感器插入Gal4转录因子的别构位点，构建了候选的ERK磷酸化Gal4（EKAR-Gal4）。在血清刺激（ERK-ON）条件下，EKAR-Gal4表达细胞的荧光报告基因表达水平约是血清饥饿（ERK-OFF）条件下的三倍，而野生型Gal4则不受血清条件影响。通过多次更换生长培养基刺激，可以增强ERK活性并相应提高报告基因表达。将EKAR底物中的磷酸化位点PRTP突变为非磷酸化的PRAP后，其活性降低，表明该开关的活性依赖于磷酸化事件。这些结果表明EKAR插入是一个有前景的起点，但仍需优化以改善其低最大振幅、有限的动态范围以及突变体中的残留活性。

**2. 铰链优化揭示别构开关设计原则**
研究人员构建了一个包含26种铰链设计的文库，发现富含GS的柔性铰链导致最高的背景活性，而富含EAAAK的螺旋铰链和富含AP的脯氨酸铰链在低背景活性和高动态范围之间取得了最佳平衡。其中，一个七氨基酸的EAAAK螺旋铰链（1b_001，命名为v1）在最大激活和折叠变化方面表现最佳。AlphaFold3结构预测和增加连接子长度实验均支持该开关通过别构机制工作。长而灵活的铰链会削弱别构偶联，而短而刚性的铰链性能更优，这与FRET生物传感器的设计原则不同。

**3. 改进底物位点和磷酸结合域以生成最佳磷酸化开关**
研究发现原始开关的非磷酸化突变体在生长培养基中仍有残留活性。通过系统突变底物肽段中可能被磷酸化的残基，研究人员发现去除所有脯氨酸、磷酸模拟残基和磷酸化位点的底物5可消除残留活性。在此基础上重新引入ERK共有磷酸化位点PRTP（或非磷酸化PRAP对照），得到了v2变体，其背景活性降低了42%。进一步对WW磷酸结合域进行R14A突变，使背景活性再降低58%，得到v3变体。最后，将螺旋铰链长度增加到17或27个氨基酸，得到v4a和v4b变体，进一步降低了背景活性。从v0到v4a/b，开关的TP/AP折叠变化从2.7倍增加到24.4倍，最大激活增加了3.5到4.6倍。开关的开启和关闭半衰期约为6小时。该开关也在小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞中得到了验证。

**4. 使用光遗传学直接且特异性激活ERK-磷酸化Gal4**
研究人员利用OptoSOS光遗传系统特异性激活ERK通路，证实了ERK-磷酸化Gal4的活性依赖于MEK/ERK通路，而非血清中的其他因素。通过改变光照强度和占空比，可以精细调控ERK-磷酸化Gal4的转录输出，表明该转录因子能响应分钟级的ERK活性变化，在活性与非活性状态间快速切换。此外，研究发现培养基中的Zn²⁺浓度会影响开关活性，高锌浓度会促进非磷酸化状态下开关的活性，这解释了非磷酸化突变体在含血清培养基中的残留活性。

**5. 将ERK-磷酸化Gal4开关作为发育细胞信号传导的生物传感器**
研究人员将优化的ERK-磷酸化Gal4系统与广泛使用的c-fos启动子（PFOS）进行比较。两者对EGF刺激的灵敏度相似（EC50分别为20和40 ng ml^-1），但ERK-磷酸化Gal4系统表现出更渐进的响应，而PFOS则呈现强烈的开关样响应。在3D类器官（gastruloids）中，ERK-磷酸化Gal4系统成功揭示了发育过程中ERK信号从均匀高表达（48小时）到极化至后极（96小时）的动态时空模式。该模式与Wnt信号通路活性变化在时空上高度对应，并且可以被FGFR抑制剂（FGFRi）PD173074消除。ERK活性区域与Brachyury转录因子的表达区域高度重叠，表明ERK可能协同Wnt信号调控这一发育过程。

**6. 磷酸化开关控制可推广到其他输入激酶和效应蛋白**
研究人员将开关的输入特异性从ERK重新连接到JNK激酶。通过替换JNK特异性底物，构建了JNK-磷酸化Gal4系统，并验证其能响应JNK激活剂茴香霉素，且该响应可被JNK抑制剂而非MEK抑制剂阻断，证明了输入特异性。在输出方面，研究人员将优化的磷酸化开关插入到抗F-肌动蛋白（F-actin）纳米抗体中，构建了ERK-磷酸化纳米抗体。血清刺激后，该纳米抗体迅速从胞质重新定位到细胞皮层，其动力学与ERK激酶活性（通过ErkKTR生物传感器测量）高度匹配，且该效应可被MEK抑制剂阻断。最后，研究人员将磷酸化开关插入到Rac1激活因子Vav2中，构建了ERK-磷酸化Vav2。EGF刺激导致细胞发生显著的、依赖于ERK活性的铺展（spreading）表型，加入MEK抑制剂后该表型可逆，实现了将ERK激酶活性直接重连以控制细胞形态。

**总结与讨论**

本研究证明了工程化磷酸化控制的别构为构建可定制的激酶-靶蛋白输入/输出接口提供了有吸引力的途径。研究揭示，别构磷酸化开关的设计约束与衍生它们的FRET生物传感器不同，短而刚性的铰链和弱化磷酸结合域与非磷酸化底物亲和力的突变能改善开关性能。该研究提供了一种简单且特异的转录传感器，可用于感知整合的激酶活性，并展示了将内源ERK信号重连以控制新细胞表型（如Rac1依赖性细胞铺展）的能力。这项工作是迈向完全通用化方法的第一步，其中任何激酶都可以“接入”以控制任何靶蛋白。未来需要扩展磷酸结合域（如FHA1、SH2）以拓宽适用范围，并增加具有强效别构控制位点的效应蛋白集合。

**研究结论（翻译）**
这项工作是迈向完全通用化方法的第一步，其中任何激酶都可以“接入”以控制任何靶蛋白。我们优化的磷酸化开关基于WW结构域，它非常适合检测丝裂原活化蛋白激酶和周期蛋白依赖性激酶家族的脯氨酸导向激酶的磷酸化。可能需要额外的磷酸结合结构域（例如，FHA1、SH2）来拓宽可使用的激酶和底物的范围。也有可能将基于WW的开关扩展到脯氨酸导向靶标以外的磷酸化底物，因为磷酸化开关的分子内构型使得亲和力不如减少与非磷酸化肽的“泄漏”结合那么关键。扩大具有强效别构控制位点的效应蛋白集合也至关重要。这些工具和其他工具可能有助于迎来一个激酶控制的转录响应和合成翻译后细胞内逻辑电路的新时代。