小鼠丘脑网状核中表达小清蛋白神经元的传入与传出投射

《Progress in Neurobiology》：Afferent and Efferent Projections of Parvalbumin-Expressing Neurons in the Thalamic Reticular Nucleus of the Mouse

　　摘要：目前已在群体层面研究了丘脑网状核中含小清蛋白的阳性神经元的全脑连接特性，但这类神经元的单细胞投射图谱多样性及其相应的电生理差异仍不完全清楚。在本研究中，我们通过神经回路追踪、高分辨率荧光显微断层扫描以及全细胞膜片钳记录技术，系统分析了PV-Cre小鼠中TRNPV神经元的三维全脑投射模式与电生理特性。研究结果表明，这些神经元接收来自皮层的广泛输入，主要投射至丘脑背侧区域，并具有特定的分布模式。值得注意的是，腹侧TRNPV神经元更倾向于投射至一级丘脑核，且其内在兴奋性较高；而背侧TRNPV神经元则投射至更高阶的丘脑核，兴奋性较低——这种背腹向的功能梯度将PV+/SOM+神经元的投射二分法扩展为单细胞分辨率下的连续空间轴。这些发现构建了一个具有空间组织结构的皮层-丘脑网状核-丘脑调控框架，为理解感觉信息调控机制以及神经精神疾病中的丘脑皮层功能紊乱提供了理论依据。

引言：丘脑网状核是一种位于外髓板与内囊之间的薄层结构，覆盖在丘脑的侧面。它向前延伸并与腹前核融合，向下与丘脑基部的不确定带相连（Li等人，2020年）。丘脑网状核主要由γ-氨基丁酸能神经元构成，是丘脑系统的主要抑制中枢（Hou等人，2016年）。这些神经元主要表达钙结合蛋白如小清蛋白，以及神经肽如生长抑素，二者均具有特定的表达模式和功能特征（Crabtree，2018年；Hoseini等人，2021年）。作为丘脑皮层投射的关键调节器，丘脑网状核接收来自大脑皮层和丘脑的兴奋性输入，同时向丘脑中继核输出抑制性信号，从而控制信息传递（Clemente-Perez等人，2017年）。在单细胞层面，Jones发现丘脑网状核神经元按功能分为不同的区域（Jones，1975年）。它们的抑制性投射同样具有空间定位性，且针对一级和中高级中继核的功能也有所不同（Lam和Sherman，2007年）。Clemente-Perez等人（2017年）以及Martinez-Garcia等人（2020年）进一步表明，丘脑网状核核心区域的PV+/CB+神经元倾向于投射至一级中继核，而壳层区域的SOM+神经元则投射至更高阶中继核——这种细胞类型特异性的投射规律在Li等人的转录组分析中也得到了体现（Li等人，2020年）。Allen小鼠脑连接图谱则提供了群体层面的丘脑网状核PV阳性轴突输出的全脑映射（Oh等人，2014年）。本研究在已有基础上，进一步从单细胞分辨率层面揭示了这些神经元的投射特异性、树突结构及电生理差异。

丘脑网状核参与多种生理和病理过程，包括感觉处理（Chen等人，2024年；Wang等人，2018年）、行为节律生成（Dong等人，2019年；Thankachan等人，2019年），以及神经精神疾病（Abdelaal等人，2022年；Steullet等人，2018年；You等人，2021年）。这些功能由丘脑网状核不同亚区的神经元负责，这些神经元形成独立的、状态依赖性的子网络，用于调控感觉信息传递并维持注意力（Halassa等人，2014年）。例如，背侧丘脑网状核投射至外侧膝状体，调节视觉信息处理（Bragg等人，2017年）。口背侧丘脑网状核中的PV阳性神经元参与疼痛调节（Liu等人，2017年），而前部丘脑网状核中的此类神经元则与意识调控相关（Yi等人，2024年）。这种区域专业化使得丘脑网状核能够同时调控多种功能。

在丘脑网状核中，表达小清蛋白的神经元占主导地位。不过，关于这类神经元的相对比例，不同研究结果差异较大——从约50%到超过90%不等——这一差异取决于所研究的物种、取样的丘脑网状核亚区以及标记方法的不同（例如基于活动依赖性的小清蛋白免疫反应性与基因编码的Pvalb报告基因线）（Janickova等人，2020年；Nakano等人，2018年）。这种差异并非仅由技术因素造成，因为丘脑网状核还存在其他分布不均的分子亚群（尤其是表达生长抑素的神经元），而这些不同亚区在细胞类型组成上的差异，正是本研究探讨亚区异质性的重要原因。这类神经元具有相对较大的胞体（直径为15–25微米），其树突长度更长、分支更多，树突覆盖范围也更广，相较于其他类型的丘脑网状核神经元更为发达（Janickova等人，2020年；Nakano等人，2018年）。PV阳性神经元具有快速放电特性，静息膜电位约为-65至-70毫伏，输入电阻较低（100–200兆欧），膜时间常数较短，因此能够对突触输入做出快速响应（Clemente-Perez等人，2017年；Liu等人，2019年）。这些结构和电生理特征有助于提升其突触连接密度及整合能力。PV阳性神经元的轴突主要投射至丘脑中的各类中继核，如外侧膝状体、腹后内侧核以及腹后外侧核（Lee等人，2024年；Nakano等人，2018年）。值得注意的是，单个TRNPV神经元可同时向多个丘脑核投射，这表明它们可能在协调不同的神经通路中发挥作用（Dong等人，2019年）；与此一致的是，单个丘脑网状核神经元在其靶丘脑核内会形成复杂的轴突分支结构（Cox等人，1996年）。

大脑皮层是向丘脑网状核发送传入信号的主要来源（Fernandez等人，2017年；Janickova等人，2020年）。例如，初级视觉皮层中的神经元主要投射至丘脑网状核的视觉区域，而初级听觉皮层中的神经元则投射至其听觉区域（Imaizumi等人，2018年；Li等人，2024年）。此外，丘脑中的其他中继核，如背外侧膝状体和腹后核，也会向丘脑网状核发送轴突侧支，形成反馈回路（Campbell等人，2020年；Li等人，2020年）。来自皮层的输入信号还根据其来源层级在丘脑网状核中有所区分，核心区域以第六层神经元为主，而壳层区域则以第五层神经元居多（Whilden等人，2021年）。尽管已有诸多研究成果，但在细胞类型层面仍有两个问题尚未得到解答：（1）TRNPV神经元的全脑输入特征是什么？其空间分布有何规律？（2）不同亚区的TRNPV神经元在投射目标及内在电生理特性上是否存在协同差异，从而解释其特定的功能？虽然先前的研究已建立了丘脑网状核神经元的分子身份、内在兴奋性与其广泛投射目标之间的关联（Clemente-Perez等人，2017年；Li等人，2020年），但目前尚无结合全脑单突触输入映射、基于HD-fMOST的技术进行单神经元投射图谱重建以及亚区特异性膜片钳记录的综合研究。本研究正是填补了这一空白，从单细胞层面揭示了丘脑网状核背腹向不同亚区的输入-输出连接特性及电生理差异。

在本研究中，我们利用基因病毒追踪技术与全细胞膜片钳技术，绘制了丘脑网状核神经元的全脑连接图谱，并分析了其电生理特性。我们假设TRNPV神经元并非功能上均一的群体，而是包含多种亚区特异性亚型，这些亚型具有不同的输入来源、投射目标、树突结构及电生理特性，共同构成了一个具有空间组织结构的调控系统。为验证这一假设，我们在PV-Cre小鼠中采用了依赖于Cre蛋白的病毒追踪技术、基于HD-fMOST的单神经元投射图谱重建技术以及全细胞膜片钳记录技术。这项工作为解析丘脑网状核中不同细胞类型的电路功能提供了全面框架，也为未来研究其生理功能及调控机制奠定了基础。

实验动物：所有病毒追踪实验（2.2 手术与立体定向注射、2.3 组织学与免疫染色、2.4 荧光显微断层扫描、2.5 图像处理与定量分析）均使用10只8–12周龄的雄性PV-Cre转基因小鼠（JAX公司编号017320，美国缅因州巴港），体重为20–25克，这些小鼠购自Jackson实验室；其中4只用于全脑单突触输入映射分析，6只用于单神经元输出投射图谱重建分析。

TRNPV神经元的细胞类型特异性输入与输出映射：为标记PV阳性神经元，我们使用了PV-Cre转基因小鼠以及依赖于Cre蛋白的病毒载体。形态学分析结果显示，PV阳性神经元广泛分布于小鼠大脑的多个区域，包括大脑皮层、海马体、丘脑、下丘脑、小脑和脑干。在丘脑中，PV阳性神经元的胞体与轴突密集分布在丘脑网状核中（图1A）。在进行单突触输入追踪时，我们同时注入了两种腺相关病毒的混合液。

讨论：PV阳性神经元是丘脑网状核中占比最高的细胞类型，阐明其全脑连接特性对于理解丘脑网状核在丘脑皮层回路中的作用至关重要。在本研究中，我们结合依赖于Cre蛋白的病毒追踪技术与fMOST全脑成像技术，首次构建了小鼠TRNPV神经元的全面输入-输出连接图谱。此外，我们还对不同丘脑网状核亚区中的PV阳性神经元进行了全细胞膜片钳记录分析。

结论：本研究实现了对TRNPV神经元传入信号与传出投射的全细胞分辨率全脑连接图谱分析，将以往针对特定细胞类型的连接特性研究（Clemente-Perez等人，2017年；Martinez-Garcia等人，2020年）拓展到了单个神经元层面，同时将输入映射、输出投射图谱分析以及亚区电生理特性分析整合在统一的分析框架之中，明确了这类神经元“空间上有序划分的输入信号与功能特性”的核心特征。

伦理审批与知情同意：本项研究在实验动物实验过程中遵循与人类研究相同的严格标准。整个实验过程始终以动物福利为首要考量，遵循3R原则，尽力减少动物的痛苦，仅使用必要数量的动物，并确保所有实验操作都具有伦理合理性及科学必要性。研究过程中预先设定了人性化的终止标准，以尽量减轻动物的痛苦。研究人员及动物实验设施的技术人员均接受了相关培训。

资金支持：本项目得到了以下资助：脑科学与类脑智能技术国家科技重大专项（项目编号2021ZD0204403，资助对象为张明梅、张福祥和李永强）、国家自然科学基金（项目编号82371246，资助对象为张明梅；项目编号82130034、82471254和82221001，资助对象为李永强），以及陕西省青年拔尖人才计划（项目编号2024JC-JCQN-74，资助对象为张明梅）。

人类研究：不适用。

作者贡献说明：张明梅、张福祥和李永强负责研究设计及 manuscript编辑工作；李亚军和邱新通负责实验实施及数据分析；王汉杰和潘立立负责全细胞膜片钳记录工作；任晓、赵天宇、郭玉涛和王志岩负责细胞计数及统计分析工作；李亚军和李飞负责文本修改工作；李亚军负责撰写 manuscript初稿；所有作者均参与了最终版本的审阅与确认工作。

作者贡献详细列表：任晓：可视化分析、方法学研究、正式数据分析。邱新通：方法学研究、数据整理。张明梅：写作与编辑、结果验证、研究监督、项目管理、资金申请、概念构思。李亚军：初稿撰写、可视化分析、正式数据分析。李永强：写作与编辑、结果验证、研究监督、资金申请。张福祥：研究监督、概念构思。赵天宇：可视化分析、资源获取、正式数据分析。李飞：

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

作者名单：李亚军|邱新通|任晓|王汉杰|郭玉涛|王志岩|潘立立|李飞|赵天宇|张福祥|李永强|张明梅

单位：中国西安第四军医大学解剖学、组织学与胚胎学系及K.K. Leung脑科学研究中心，邮编710032