肺炎克雷伯菌通过荚膜和T6SS依赖性途径抑制血管舒张

《Nature Microbiology》：Klebsiella pneumoniae inhibits vasodilation through capsule and T6SS-dependent pathways

　　

血管舒张是炎症和感染期间的一种防御机制，由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的一氧化氮以及内皮依赖性超极化（EDH）的生成所调控。已有多种病毒感染被证明可改变血管生物学，但细菌病原体的影响尚不清楚。本研究利用离体血管模型和人类原代内皮细胞，研究人员发现，一种常见的血流病原体——肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）可抑制血管舒张通路。VI型分泌系统（T6SS）效应子VgrG4激活线粒体受体NLRX1，导致线粒体活性氧（mtROS）增加，并通过激酶PKCβ磷酸化eNOS抑制位点，从而降低eNOS活性。肺炎克雷伯菌的荚膜多糖（CPS）还可激活磷酸酶PP2Ac，后者减少eNOS激活位点的磷酸化。VgrG4诱导的线粒体活性氧通过损害Ca²⁺激活的K⁺通道轴信号传导，减弱内皮依赖性超极化。这项工作揭示了T6SS活性可通过靶向eNOS翻译后修饰来调节宿主血管生物学。

**肺炎克雷伯菌通过荚膜和T6SS依赖性途径抑制血管舒张的机制研究解读**

**研究背景与问题**

血管舒张是炎症和感染期间的重要防御机制，主要依赖于内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化产生的一氧化氮（NO）以及内皮依赖性超极化（EDH）的协同作用。多种病毒病原体（如埃博拉、拉沙病毒）已被证实可扰乱血管生物学，但细菌病原体如何影响血管功能，尤其在不引起脓毒症广泛内皮功能障碍的情况下，其机制尚不明确。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是血流感染（BSI）中第二常见的革兰阴性病原体，死亡率高达79%，且临床观察发现其感染与高血压相关，动物实验显示感染后动脉血管舒张受限。然而，肺炎克雷伯菌与血管系统之间的分子界面仍存在认知空白。因此，研究人员旨在阐明肺炎克雷伯菌通过何种分子机制破坏血管功能，特别是抑制血管舒张通路。

**研究设计**

本研究整合了离体血管模型（大鼠肠系膜动脉）和人类原代内皮细胞（HULEC-5a及HPMECs）作为研究平台。主要关键方法包括：1）压力肌动描记系统（pressure myograph system）实时测量血管外径变化，评估乙酰胆碱（ACh）诱导的血管舒张；2）Cal-520钙成像结合高时空分辨率宽场成像，分析内皮细胞钙信号动态；3）免疫印迹检测eNOS磷酸化位点（Ser1177和Thr495）及信号通路蛋白；4）siRNA敲低技术验证关键分子（NLRX1、PKCβ、PP2Ac等）的功能；5）MitoSOX荧光探针定量线粒体活性氧（mtROS）；6）小鼠尾套法血压测量及腹腔感染模型评估体内效应。样本来源包括大鼠肠系膜动脉、人类肺微血管内皮细胞系，以及C57BL/6小鼠。

**研究结果**

**1. K. pneumoniae抑制激动剂诱导的血管舒张**

离体实验显示，肺炎克雷伯菌菌株Kp43816（10⁴ CFU）经管腔内感染后，显著抑制ACh诱导的血管舒张。使用NO通路抑制剂L-NAME无法消除感染后的残余舒张，而EDH通路抑制剂TRAM-34和apamin则完全消除，提示感染消除了NO依赖性舒张，并减弱EDH介导的舒张。NO供体硝普钠（SNP）可恢复舒张，表明平滑肌功能完整。组织学检查未发现血管结构损伤。不同菌株（NTUH-K2044、AKP5、MRSN-14444）均抑制ACh诱导的舒张，表明该表型具有菌株普适性。体内实验证实，腹腔感染24小时后小鼠收缩压和舒张压显著升高，达到高血压水平。

**2. VgrG4是抑制血管舒张的T6SS效应子**

与野生型不同，tssB突变体（T6SS装置缺失）和vgrG4突变体均不能抑制ACh诱导的血管舒张，且vgrG4互补菌株恢复抑制能力。利用耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）T3SS递送系统，单独表达VgrG4的菌株（YeVgrG4）足以抑制ACh诱导的血管舒张，证明VgrG4是必要且充分的效应子。

**3. K. pneumoniae不损害内皮细胞钙信号**

在HULEC细胞中，Kp43816感染未降低组胺诱导的Ca²⁺反应，甚至低浓度下有所增强。离体血管内皮钙成像显示，感染后ACh诱发的钙信号幅度、活性细胞比例和事件数量均未减少，反而增加。药理学阻断证实反应由毒蕈碱M3受体介导。因此，血管舒张抑制并非由钙信号受损引起。

**4. K. pneumoniae靶向eNOS翻译后修饰**

免疫印迹显示，Kp43816感染不改变eNOS蛋白水平，但通过两种独立机制调控其磷酸化：1）抑制激动剂诱导的Ser1177激活位点磷酸化，该效应依赖于荚膜多糖（CPS），因为cps突变体（ΔmanC）无此作用；2）诱导Thr495抑制位点磷酸化，该效应依赖于T6SS和VgrG4，因为tssB和vgrG4突变体无此作用，而YeVgrG4可诱导该磷酸化。Thr495磷酸化单独即可抑制eNOS活性。

**5. CPS通过EGFR–PP2Ac通路限制eNOS(Ser1177)磷酸化**

Kp43816感染上调磷酸酶PP2Ac水平，cps突变体则无此效应。siRNA敲低PP2Ac后，感染不再抑制Ser1177磷酸化。机制上，CPS通过TLR4–EGFR–PI3K–AKT–PAK4–ERK–GSK3β信号级联上调PP2Ac。药理学抑制EGFR、PI3K、AKT、MEK或表达组成型活性GSK3β（GSK3β(CA)）均阻断PP2Ac上调。

**6. VgrG4通过NLRX1–mtROS–PKCβ通路磷酸化eNOS(Thr495)**

Kp43816感染诱导PKC激活，且依赖于T6SS。siRNA筛选显示PKCβ是介导Thr495磷酸化的关键亚型。VgrG4依赖性地诱导mtROS产生（MitoSOX检测），mtROS清除剂MitoTEMPO阻断PKC激活和Thr495磷酸化。siRNA敲低线粒体免疫受体NLRX1后，mtROS产生和Thr495磷酸化均被抑制，表明VgrG4通过NLRX1–mtROS–PKCβ轴发挥作用。

**7. 靶向mtROS和PKCβ恢复血管舒张**

MitoTEMPO可恢复感染血管中ACh诱导的血管舒张，包括NO和EDH通路。PKCβ抑制剂LY333-531部分恢复NO依赖性舒张，与cps突变体联用可完全恢复舒张。双突变体（ΔmanC-ΔvgrG4）不抑制ACh诱导的舒张。体内实验中，vgrG4突变体不引起高血压，而cps突变体虽细菌载量降低，但仍可评估VgrG4对高血压的贡献。

**讨论与结论**

本研究建立了离体血管模型与人类原代内皮细胞整合的研究平台，首次系统揭示了肺炎克雷伯菌通过两条独立通路抑制血管舒张的分子机制：T6SS效应子VgrG4激活NLRX1–mtROS–PKCβ信号，磷酸化eNOS抑制位点Thr495；荚膜多糖CPS通过TLR4–EGFR–PP2Ac通路限制eNOS激活位点Ser1177的磷酸化。VgrG4诱导的mtROS还损害SKCa–IKCa通道轴介导的EDH通路。这些离体发现转化为体内高血压表型，且依赖于VgrG4。该工作拓展了T6SS在宿主-病原体相互作用中的功能，将T6SS活性与血管生理调控直接联系起来，并揭示了病原体通过劫持宿主稳态酶（PKCβ和PP2Ac）而非直接递送效应子来操纵eNOS翻译后修饰的新范式。研究结论为：肺炎克雷伯菌通过荚膜和T6SS依赖性途径抑制血管舒张，导致内皮功能障碍和高血压，为感染相关心血管病理提供了新机制，并为宿主导向治疗（如重用心血管药物）提供了理论基础。