LOX-1介导的脂质过氧化导致卵巢癌中肿瘤浸润CD8+ T细胞功能障碍

《Redox Biology》：LOX-1 mediated lipid peroxidation leads to dysfunction of tumor infiltrating CD8+ T cells in ovarian cancer

　　

肿瘤微环境（TME）中的异常脂质积累促进肿瘤浸润CD8⁺ T细胞（CD8⁺TILs）中的脂质过氧化，驱动其功能障碍并损害卵巢癌（OC）中的抗肿瘤免疫。为阐明潜在的免疫抑制机制，研究人员整合了临床标本、小鼠模型和体外验证。值得注意的是，来自OC患者的CD8⁺TILs表现出显著的脂质过氧化特征。在卵巢肿瘤间质液（TIF）、肿瘤块衍生上清液和组织切片中检测到升高的氧化低密度脂蛋白（oxLDL）水平，与CD8⁺TILs中加速的过氧化表型相关。批量RNA测序和实验验证揭示，LOX-1是CD8⁺TILs中主要的oxLDL受体，其表达与过氧化水平以及PRF1、GZMB和IFNG的产生呈负相关。在ID8小鼠OC模型中，CD8⁺TILs中LOX-1上调和脂质过氧化随肿瘤进展而增加，而LOX-1中和抗体治疗部分逆转了这些变化并恢复了T细胞功能。在体外，LOX-1阻断减少了oxLDL诱导的脂质过氧化，恢复了IFN-γ和GZMB的产生，并下调了PD-1表达，而LOX-1过表达则产生相反效果。值得注意的是，抗氧化剂而非铁死亡抑制剂通过抑制过氧化恢复了CD8⁺ T细胞效应功能。机制上，oxLDL/LOX-1信号激活了转录因子ELF3，后者随后结合到PDCD1启动子以驱动PD-1表达。总之，本研究证明，在CD8⁺TILs中，LOX-1介导的oxLDL摄取通过氧化应激诱导脂质过氧化，并确立了oxLDL/LOX-1轴作为脂质过氧化损害OC中CD8⁺TIL功能的关键通路。靶向LOX-1或使用抗氧化剂恢复了CD8⁺TILs的抗肿瘤能力，为代谢调节T细胞为基础的癌症免疫治疗提供了机制基础。

**论文解读：LOX-1介导的脂质过氧化导致卵巢癌中肿瘤浸润CD8⁺ T细胞功能障碍**

**研究背景**
卵巢癌（OC）是一种典型的免疫抑制性恶性肿瘤，免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗在OC中疗效有限，主要原因是肿瘤微环境（TME）中CD8⁺ T细胞浸润不足和功能耗竭。TME中异常脂质积累（如氧化低密度脂蛋白（oxLDL））可诱导CD8⁺ T细胞（CD8⁺TILs）脂质过氧化，导致其功能障碍。然而，oxLDL是否以及如何通过脂质过氧化驱动OC中CD8⁺TILs功能障碍的分子机制尚不明确。现有研究多聚焦于oxLDL对肿瘤细胞代谢的影响，其在免疫调节中的作用，特别是对CD8⁺TILs的影响，知之甚少。因此，揭示脂质过氧化损害CD8⁺TILs功能的分子机制，对于开发更有效的OC免疫治疗策略至关重要。

**研究内容与结论**
研究人员通过整合临床标本（来自南京医科大学第一附属医院和南京妇女儿童保健医院）、小鼠模型和体外实验，系统验证了OC中CD8⁺TILs的脂质过氧化特征，并阐明了LOX-1介导的oxLDL摄取通过氧化应激诱导脂质过氧化，进而激活ELF3/PD-1轴导致CD8⁺TILs功能障碍的机制。主要结论包括：
1. OC患者CD8⁺TILs表现出显著的脂质过氧化，且TME中oxLDL富集驱动了这一过程。
2. LOX-1是CD8⁺TILs上主要的oxLDL受体，其表达与脂质过氧化水平及CD8⁺TILs功能呈负相关。
3. 在ID8小鼠模型中，LOX-1中和抗体治疗能部分逆转脂质过氧化，恢复CD8⁺TILs功能并抑制肿瘤生长。
4. 抗氧化剂（如α-生育酚、夹竹桃麻素）可逆转oxLDL诱导的脂质过氧化和CD8⁺T细胞功能障碍，而铁死亡抑制剂（Fer-1、DFO）无效。
5. 机制上，oxLDL/LOX-1信号激活转录因子ELF3，ELF3直接结合PDCD1启动子驱动PD-1表达，导致CD8⁺TILs功能受损。

该研究首次揭示了OC中氧化脂质通过LOX-1/ELF3/PD-1轴抑制CD8⁺TILs功能的免疫代谢机制，为靶向LOX-1或使用抗氧化剂恢复T细胞抗肿瘤免疫提供了理论基础。论文发表在《Redox Biology》。

**主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：
- 临床标本收集：采集OC患者和健康供体的外周血、肿瘤组织及肿瘤间质液（TIF），样本来源明确（南京医科大学第一附属医院和南京妇女儿童保健医院）。
- 小鼠模型：采用C57BL/6J小鼠皮下注射ID8卵巢癌细胞或B16黑色素瘤细胞，建立肿瘤模型，并进行腹腔注射anti-LOX-1抗体治疗及CD8⁺ T细胞耗竭实验。
- 体外实验：使用磁珠分选（MACS）从人外周血单个核细胞（PBMCs）中富集CD8⁺ T细胞，建立肿瘤上清共培养体系，并用oxLDL直接刺激。
- 组学分析：对临床CD8⁺T细胞进行批量RNA测序，结合公共单细胞RNA-seq数据库（GSE154600）进行受体筛选和转录因子富集分析。
- 分子生物学：采用慢病毒介导的OLR1和ELF3过表达、CRISPR-Cas9敲除ELF3、CUT&RUN-qPCR和双荧光素酶报告基因实验验证转录调控机制。
- 流式细胞术：检测脂质过氧化探针（DCFH-DA、Liperfluo、BODIPY 581/591 C11）、细胞因子（IFN-γ、GZMB）及PD-1表达。

**研究结果**

**1. oxLDL富集在TME中诱导CD8⁺TILs脂质过氧化**
通过批量RNA测序分析，发现OC患者肿瘤组织来源的CD8⁺ T细胞（OCT组）中脂质过氧化相关通路显著富集。流式细胞术证实，OCT组CD8⁺TILs的DCFH-DA、Liperfluo和BODIPY 581/591 C11信号均显著高于外周血来源的CD8⁺ T细胞。体外肿瘤上清共培养系统模拟了类似过氧化表型。定量检测显示，OC患者肿瘤组织上清和TIF中oxLDL水平显著高于血清和正常组织，且oxLDL与CD8⁺ T细胞共定位。使用抗oxLDL中和抗体（Orticumab）处理可降低CD8⁺ T细胞的脂质过氧化信号，而oxLDL以浓度依赖方式诱导脂质过氧化，天然LDL无此效应。

**2. LOX-1作为CD8⁺TILs上主要的oxLDL受体，可能通过诱导CD8⁺TILs功能损伤驱动肿瘤进展**
利用公共单细胞RNA-seq数据库和自身RNA-seq数据，发现OLR1（编码LOX-1）在CD8⁺TILs中表达显著上调，且是变化最显著的oxLDL清道夫受体基因。LOX-1蛋白在CD8⁺TILs表面高表达，与CD8A共定位。肿瘤上清培养上调LOX-1表达，而抗LOX-1抗体减少DiI-oxLDL摄取。LOX-1过表达增强oxLDL摄取，且oxLDL以浓度依赖方式上调LOX-1表达并降低细胞活力。TCGA数据分析显示，OLR1高表达与OC患者较差的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关，且与CD8⁺ T细胞浸润相关。在临床标本中，LOX-1⁺CD8⁺TILs脂质过氧化水平更高，IFN-γ产生更低，且LOX-1高表达组细胞毒性分子（PRF1、GZMB、IFNG）mRNA水平显著降低。

**3. 干预LOX-1在小鼠模型中减轻CD8⁺TILs脂质过氧化并增强抗肿瘤细胞因子分泌**
在ID8皮下小鼠模型中，CD8⁺TILs中LOX-1表达随肿瘤进展（4周至8周）增加，同时脂质过氧化水平升高。抗LOX-1治疗显著抑制肿瘤生长，增加CD8⁺ T细胞浸润，降低DCFH-DA、Liperfluo和BODIPY信号，并上调GZMB和IFN-γ表达。在B16模型和腹腔注射模型中观察到类似结果。CD8⁺ T细胞耗竭实验证实，抗LOX-1的抗肿瘤作用主要依赖于CD8⁺ T细胞，但仍有部分残余效应，提示可能存在非CD8⁺ T细胞依赖性机制。

**4. LOX-1是介导CD8⁺TILs脂质过氧化和抗肿瘤功能的关键受体：体外模型证据**
在肿瘤上清共培养系统和oxLDL直接刺激模型中，抗LOX-1抗体显著降低脂质过氧化信号，恢复IFN-γ和GZMB产生，并下调PD-1表达。相反，LOX-1过表达增强脂质过氧化，抑制IFN-γ和GZMB，并上调PDCD1 mRNA和PD-1蛋白。抗LOX-1处理可逆转这些效应。TCGA分析显示，OLR1高表达与多种免疫检查点分子正相关。

**5. 脂质过氧化诱导的CD8⁺TILs功能障碍可被抗氧化剂减轻，但对铁死亡抑制不敏感**
抗氧化剂α-生育酚（维生素E）显著抑制oxLDL诱导的脂质过氧化，恢复IFN-γ和GZMB表达，并降低PD-1。NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素（apocynin）也产生类似效果。然而，铁死亡抑制剂Fer-1（ferrostatin-1）和DFO（deferoxamine）在25 μg/mL或50 μg/mL oxLDL处理以及肿瘤上清培养条件下均未能显著降低脂质过氧化水平。

**6. ELF3通过oxLDL诱导的PDCD1激活损害CD8⁺ T细胞抗肿瘤功能**
通过转录因子富集分析，从OCT vs HCP、OCT vs OCP、oxLDL vs control三组差异表达基因中鉴定出10个核心转录因子，其中ELF3在OCT组中表达上调最显著，且与OC患者不良预后相关。在临床标本中，OCT组CD8⁺ T细胞的ELF3 mRNA和蛋白水平显著高于HCP和OCP组。oxLDL通过LOX-1上调ELF3表达，抗LOX-1抗体或α-生育酚可抑制此效应，LOX-1过表达则增强。ELF3过表达选择性上调PDCD1 mRNA，而敲除ELF3可降低oxLDL诱导的PD-1表达。CUT&RUN实验证实ELF3直接结合PDCD1启动子区域，双荧光素酶报告基因实验验证了ELF3依赖的PDCD1转录激活。

**讨论与结论**
**讨论部分总结**：本研究揭示了OC中TME内oxLDL通过LOX-1受体介导CD8⁺TILs脂质过氧化，进而激活ELF3/PD-1轴导致T细胞功能障碍的新机制。与既往报道的CD36在不同肿瘤中作用不同，OC中LOX-1是CD8⁺TILs上主要的oxLDL受体，这可能与OC独特的代谢特征和清道夫受体表达模式有关。LOX-1阻断不仅通过CD8⁺ T细胞依赖方式抑制肿瘤生长，还可能通过非CD8⁺ T细胞机制（如影响肿瘤细胞自身或中性粒细胞）发挥作用。抗氧化剂有效逆转脂质过氧化和功能损伤，而铁死亡抑制剂无效，提示该过程不依赖铁死亡，可能与细胞类型特异性或抗氧化防御系统活性有关。研究还发现ELF3是oxLDL/LOX-1信号下游连接PD-1表达的关键转录因子，为理解OC中脂质代谢与免疫检查点调控的交叉提供了新视角。

**研究结论翻译**：总的来说，本研究表明，靶向LOX-1可能是一种改善卵巢癌中基于T细胞的免疫疗法抗肿瘤疗效的有效策略。研究还提供了一种代谢调节CD8⁺ T细胞以改善癌症免疫疗法临床效果的潜在方法。