基于对甲氧基苯胺鎓的离子固体作为潜在DNA染色剂的初步评估：DFT和分子对接研究

《Journal of Fluorescence》：Preliminary Assessment of p-Anisidinium-Based Ionic Solids as Potential DNA Staining Agents: DFT and Molecular Docking Studies

　　

本研究涉及多种基于对甲氧基苯胺鎓（p-anisidinium）的离子固体（ISs）的制备与表征，这些化合物在乙醇中的紫外-可见（UV-Vis）吸收下表现出显著的显色行为，进而指导并证实其具有DNA染色能力。结构及官能团解析结果（1H和13C核磁共振（NMR）及傅里叶变换红外光谱（FTIR））验证了这些ISs的成功制备，并证实了不同阴离子相较于原始材料对其整体颜色起到的关键作用，这归因于苯胺发色团部分以及阳离子与阴离子之间的电子相互作用。UV-Vis吸收光谱显示了三个特征谱带，分别归属于π→π*、n→π*以及分子间阴离子-阳离子电荷转移跃迁（CTT），这是基于对甲氧基苯胺鎓化合物的常见现象。研究人员通过凝胶电泳分析，评估了这些ISs作为新型替代品（可用作上样染料或荧光DNA染色染料）的潜力。在所测试的化合物中，[p-Anis]⁺[NO₂]^?被证明是一种有效的替代性上样和荧光DNA染色染料。这一观察结果进一步通过使用b3lyp/6-311++g(d, p)方法的密度泛函理论（DFT）模拟得到验证，计算得到能隙为3.40 eV，表明该化合物具有良好的化学反应性和适中的电子电导率，全局亲电性指数为3.41 eV，表明其稳定化能低且对电荷转移高度敏感。获得的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）参数表明，该化合物可溶于水，具有良好的类药性，支持其与DNA的结合亲和力，并且由于符合Lipinski和Verber规则，它可能是一种潜在的口服活性药物。分子对接模拟得到的结合能分别为：针对大肠杆菌（Escherichia coli），环丙沙星为?6.9 kcal/mol，[p-Anis]⁺[NO₂]^?为?4.9 kcal/mol；针对艰难梭菌（Clostridium difficile），甲硝唑为?5.7 kcal/mol，[p-Anis]⁺[NO₂]^?为?5.9 kcal/mol。关键残基Met404和Ala429在大肠杆菌的两个配对中均常见，而Arg272和Asp285在艰难梭菌的两个配对中均常见。

**研究背景与问题**
离子液体（ILs）化学以电子和质子转移为主导，但质子活性导致固液态产物行为的理解尚不充分。1914年P. Walden报道了首例合成离子液体（硝酸乙基铵），其熔点约12°C，远低于传统无机盐，这归因于盐组分的尺寸和非对称性导致的晶格能降低。然而，第一代ILs对水和空气敏感，后续ILs作为传统有机溶剂的绿色替代品及刺激响应性指示剂等得到发展。室温下为固体的称为离子固体（ISs）。ILs的阴-阳离子配对可调节最终性质，包括显色性（如溶致变色、热致变色等）。本研究聚焦于对甲氧基苯胺鎓（p-anisidinium）基ISs，因其结构简单（仅含单取代苯环、甲氧基和质子化苯胺基团），不同于传统DNA嵌入剂（需扁平稠合芳香面），但质子化基团可提供静电吸引，甲氧基和抗衡阴离子影响溶解度、氢键和光学响应，可能成为低成本、易处理的DNA染色替代品。传统染色剂溴化乙锭（EtBr）虽常用但具致突变性，SYBR Green类虽更安全但改变迁移率，因此需开发新型替代品。研究人员前期已确认p-anisidinium基ISs的结构纯度和热稳定性，本研究进一步评估其作为DNA染色剂的潜力，并结合计算模拟（DFT、ADME、分子对接）补充实验。论文发表在《Journal of Fluorescence》。

**技术方法概括**
研究人员采用复分解法合成了两种新的ISs（[p-Anis]⁺[DOS]^?和[p-Anis]⁺[SaL]^?），连同之前合成的两种（[p-Anis]⁺[Cl]^?、[p-Anis]⁺[NO₂]^?、[p-Anis]⁺[OAc]^?）共四种ISs进行表征。主要技术方法包括：1）通过1H和13C-NMR及FTIR进行结构解析；2）紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱分析阴离子依赖性显色行为；3）琼脂糖凝胶电泳评估DNA染色能力（作为上样染料和荧光染料），使用大肠杆菌（Escherichia coli）和艰难梭菌（Clostridium difficile）的细菌DNA样品；4）密度泛函理论（DFT）计算（b3lyp/6-311++g(d,p)）获得量子化学描述符；5）ADME参数预测（SwissADME在线程序）；6）分子对接（PyRx）将[p-Anis]⁺[NO₂]^?与标准药物（环丙沙星、甲硝唑）分别对接至大肠杆菌蛋白（PDB ID: 4E81）和艰难梭菌A毒素蛋白（PDB ID: 3SRZ）。

**研究结果**
**阴离子依赖的紫外-可见行为研究**：通过UV-Vis吸收光谱，所有ISs在270–330 nm处显示π→π*跃迁（芳香对甲氧基苯胺鎓阳离子贡献），在310–408 nm处显示n→π*跃迁（甲氧基氧和阴离子氧的孤对电子→π*轨道）。[p-Anis][NO₂]、[p-Anis][OAc]、[p-Anis][SaL]和[p-Anis][DOS]在450–650 nm处出现低能吸收带，归因于分子间阴离子-阳离子电荷转移跃迁（CTT），而非纯粹的分子内跃迁。阴离子变化导致UV-Vis谱图差异，证实了电子相互作用。与原始材料相比，所有ISs发生蓝移，归因于不同电负性元素（硫、氧）与阳离子的相互作用。理论UV-Vis与实验吻合。

**阴离子对颜色的影响**：对甲氧基苯胺发色团基于其氨基与醛酮生成席夫碱形成共轭体系产生颜色。本研究中，不同阴离子与对甲氧基苯胺鎓阳离子相互作用，产生不同颜色，表明阴离子是颜色变化的关键因素，而非仅依靠席夫碱。

**上样染料与荧光染料对比**：凝胶电泳结果显示，当[p-Anis]⁺[NO₂]^?作为上样染料时，仅DNA ladder和该IS产生微弱迁移带（蓝、紫、橙色），而作为荧光染料时，所有DNA样品在紫外下均可见荧光带。表明该IS更适合作为荧光染料而非上样染料，其微弱着色可能源于缺乏长链共轭系统及NO₂^?的荧光猝灭作用。与EtBr相比，结合模式不同。

**量子化学描述符**：DFT计算获得[p-Anis]⁺[NO₂]^?的HOMO-LUMO能隙（ΔE）为3.40 eV，表明类半导体性质及适当电子电导率；全局硬度（η）为1.70 eV，显示化学反应性；电负性（χ）为3.41 eV，归因于硝基的吸电子和共振效应；电子化学势为-3.41 eV，表明倾向于失去电子；全局亲电性指数（ω）为3.41 eV，表示低稳定化能和高电荷转移敏感性；偶极矩1.12 D，显示原子电负性差异小。

**前线分子轨道与分子静电势图**：LUMO主要由芳香碳和氢贡献，HOMO则由硝基和朝向硝基的胺氢贡献。分子静电势图（MEP）显示，蓝色区域（正电位）集中在胺氢，易受亲核攻击；红色区域（负电位）围绕硝基，易受亲电攻击。因此，对甲氧基苯胺鎓的胺取代基为最亲电区域，可能与DNA亲核位点相互作用；硝基为最亲核区域，可能与DNA亲电位点相互作用。

**ADME性质分析**：ADME预测显示，分数Csp3为0.14（略低于脂膜渗透范围），但符合Lipinski五规则（Ro5）和Verber规则：分子量、脂溶性（MLogP）、氢键供体（≤5）和受体（≤10）、拓扑极性表面积（TPSA）和可旋转键均在可接受范围内，无违反。生物利用度评分0.55，表明口服生物利用度良好。BOILED-Egg模型显示该分子位于白区，可被胃肠道被动吸收，且不被P-糖蛋白外排至中枢神经系统。

**分子对接分析**：对大肠杆菌蛋白（4E81），环丙沙星结合能-6.9 kcal/mol，[p-Anis]⁺[NO₂]^?为-4.9 kcal/mol，显示标准药物结合更强，但IS仍有良好亲和力。对艰难梭菌蛋白（3SRZ），甲硝唑结合能-5.7 kcal/mol，IS为-5.9 kcal/mol，表明IS结合更强，可能成为更优抗菌剂。关键残基：大肠杆菌中Met404和Ala429在两者中共有；艰难梭菌中Arg272和Asp285在两者中共有。2D相互作用图显示氢键、烷基/π-烷基、π-阴离子等多种作用。

**总结与讨论**
研究结论指出，研究人员成功合成了两种新的p-anisidinium基ISs（[p-Anis]⁺[DOS]^?和[p-Anis]⁺[SaL]^?），并评估了所有四种ISs（包括NO₂^?和OAc^?基）作为DNA染色材料的潜力。琼脂糖凝胶电泳显示，[p-Anis]⁺[NO₂]^?在紫外下表现出荧光染料潜力，强迁移带对应所有DNA样品。DFT模拟验证了该IS的化学反应性、低稳定化能、高电荷转移敏感性和适当电导率。ADME预测表明其符合Lipinski和Verber规则，具良好类药性和口服生物利用度，BOILED-Egg模型提示可被胃肠道被动吸收。分子对接结合能与凝胶电泳结果定性相关，表明IS与DNA结合能力，且对大肠杆菌和艰难梭菌均有潜在抗菌活性。未来需深入研究DNA结合机制、灵敏度、浓度依赖性染色及细胞毒性比较。